Western Blot困惑：为何我的蛋白条带不在理论“该在”的位置？

想必做WB的同学都或多或少出现过在根据Marker条带判断目标蛋白的表观分子量时发现与预期分子量不符的情况，这究竟是怎么回事呢？是实验失败了吗？还是Marker不准？抗体有问题？亦或者蛋白本身有“猫腻”呢？本文将系统解析造成这种不一致的多种原因，帮助大家正确解读结果、优化实验并避免误判。

SDS-PAGE分离原理的再认识

SDS-PAGE 通过SDS 电荷均一化（使蛋白带均匀负电荷）和凝胶分子筛效应分离蛋白。其分离基础是完全变性还原条件下线性多肽链的分子量（更准确地说，是迁移率与其分子量对数成反比）。此时，Marker 的指示才接近真实分子量。

在区分清楚理论分子量和表观分子量后，我们接下来将深入解析下不一致的“罪魁祸首”。

蛋白翻译后修饰（PTMs）

▪糖基化：添加糖链 → 增大水合体积 → 迁移变慢 → 表观 > 理论

▪磷酸化：添加磷酸基团 → 电荷效应为主 → 迁移略快/略慢 → 多修饰可累加

▪泛素化/SUMO化：添加大肽链 →分子量显著增大 → 迁移变慢 → 表观 >> 理论 (常伴拖尾)

▪脂化：添加疏水基团 → 影响SDS结合/聚集 → 迁移异常 (快/慢不定)

▪切割：前体变小 → 迁移变快 → 表观 < 理论 (如酶原激活、信号肽切除)

蛋白结构特性

▪氨基酸组成：特定氨基酸（如 Pro, Gly）影响肽链构象/刚性 → 迁移异常

▪二硫键：还原不足 → 折叠残留 → 迁移变慢 → 表观 > 理论

▪疏水性：极端疏水 → SDS 结合/变性不足 → 迁移变慢

▪多结构域/异常构象：复杂结构 → 影响 SDS 结合/分子形状 → 迁移异常

实验因素

☑ 样品制备

▪变性/还原不足：(常见!) SDS结合不均/二硫键残留 → 蛋白未线性化 → 迁移变慢

▪过度煮沸：易致聚集 (甘油/还原剂不足时尤甚) → 聚集体滞留胶孔/顶部

▪蛋白酶降解：蛋白裂解 → 小片段条带出现于低分子量区或主带下移

☑ 电泳条件

▪凝胶浓度不当：浓度过低 → 低分子量蛋白分离差；浓度过高 → 高分子量蛋白分离差

▪缓冲系统：不同的缓冲液系统蛋白分子量指示可能略有差异，建议结合Marker 说明书确定

▪电压/时间不当：过高/过长 → 条带扩散、变形 (e.g., 微笑/哭脸效应) → 定位不准

☑ Marker本身

▪Marker 选择：蛋白组成/修饰状态 (e.g., 预染Marker常为添加染料的重组蛋白) → 影响迁移“标准性”

▪Marker 批次/质量：批次差异/质量差 → 条带模糊、偏移

▪Marker 适用性：特定条件 (e.g., 凝胶浓度、缓冲液如 Tris-Tricine) 下可能非线性迁移

其他因素

▪同源蛋白/异构体：存在剪接变体或翻译后修饰不同的亚型，可能跑出多条带或位置有差异。

▪抗体特异性：抗体识别了非特异性条带或降解产物（这是造成“假”不一致的重要原因！需通过敲除/敲低实验、不同抗体验证、质谱等确认条带特异性）。

了解了以上原因，想必大家就明白了：蛋白Marker指示的表观分子量与理论分子量不一致是常态而非例外，主要由蛋白翻译后修饰、结构特性以及可控的实验因素共同导致。这种“不一致”本身可能蕴含着重要的生物学信息（如蛋白修饰状态、激活状态、存在异构体等），不应简单视为实验失败。 我们应系统性地排查（抗体特异性、实验操作、蛋白特性），结合文献和验证实验，正确解读条带位置，避免误判。

只有掌握这些原因，才能找出解决方法，提升实验技能，更深入地理解研究对象。

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