获得高质量细胞能量代谢数据的核心要素——正确的归一化

细胞能量代谢是驱动细胞表型的关键因素，直接影响细胞的命运和功能。与此同时，细胞在其发育周期中或环境应激及治疗干预后，可能会发生代谢重编程。因此，在癌症等重大疾病的研究中，使用安捷伦Seahorse XF代谢分析技术开展线粒体呼吸（OCR）和糖酵解（ECAR）等细胞能量特征检测至关重要，有助于揭示驱动疾病表型的细胞能量机制。

数据归一化(标准化)的重要性

归一化在生物学实验中具有不可替代的重要性。它不仅可以校正实验误差、提高数据可比性、优化数据分析过程，还可以为后续的生物学实验和研究提供可靠的基础。因此，在进行生物学实验时，应充分重视归一化这一步骤，并选择合适的归一化方法以确保实验数据的准确性和可靠性。

在开展Seahorse XF代谢分析检测时，许多因素（例如增殖速率、细胞分化程度、黏附效率等）会影响上机检测时的实际细胞密度以及细胞在孔板内生长的均匀性，这些最终会影响检测数据的准确性（图1）。因此数据的归一化是Seahorse XF原始数据展示和后续分析工作流程中的关键因素，它能够校正不同孔中细胞数量的差异（参考文献1,2）以确保获得准确可靠的实时细胞代谢测量值。

图 1：在 Seahorse XF 板中以不同密度接种的人类初始 T 细胞，使用Cytation 进行明场图像拍摄：（A）1.5×10⁵ 个细胞/孔，（B）2×10⁵ 个细胞/孔，（C）2.5×10⁵ 个细胞/孔。在细胞过载的情况下，细胞在孔的边缘聚集。

细胞能量代谢归一化（标准化）解决方案

进行数据归一化的方法有很多，包括总蛋白归一化、基因组DNA 均一化以及基于图像的细胞计数等，值得注意的是，在细胞能量代谢检测过程中不推荐使用任何基于细胞代谢定量分析细胞数的方法，例如MTT检测，ATP 水平检测。

为了帮助研究者在使用 Seahorse XF 进行活细胞能量代谢检测中快速有效地进行标准化校正，以获得更准确可靠的实验结果，安捷伦针对贴壁细胞和悬浮细胞分别开发和优化了两种最简单且直接的归一化解决方案。

• 贴壁细胞：推荐使用基于成像的自动化细胞计数方法

• 悬浮细胞：推荐使用基于流式细胞术的细胞计数方法

1. 基于成像技术的能量代谢检测均一化工作流程

根据贴壁细胞的生长特性，安捷伦BioTek Cytation细胞成像多功能微孔板检测仪为Seahorse XF 技术提供可一套自动化的细胞计数工作流程，便于用户快速而简便的开展XF数据归一化。

工作流程概述：RAW264.7、A549、SKOV3 和 HepG2 细胞在培养过夜后，其代谢表型通过安捷伦 Seahorse XF 细胞能量表型测试方案进行评估。优化方案对原Seahorse XF Protocol进行了如下优化：

1. 在寡霉素/FCCP 混合液中加入了 20 μM 的 Hoechst 33342，这一步骤可以减少手动注入染料带来的系统误差，并且简化操作步骤

2. 细胞计数使用 BioTek Cytation 5 及 XF 细胞成像和计数软件完成，并在 Wave 软件中进行数据标准化。

3. XF 细胞成像和计数软件收集了明场和荧光标记的细胞核图像，这些图像经过分析后整合到 XF 代谢分析数据中。

4. 每孔的细胞数量通过 Cytation 5 捕获的荧光标记细胞核图像进行自动计数确定。图2和图3展示了采用数据标准化流程后数据质量显著提升。

图 2：在成像标准化工作流程中，RAW264.7 细胞于实验前一天以不同密度接种。在进行标准化前，使用Cytation 基于核染色进行细胞计数，OCR 和 ECAR 数据的离散程度显著高于标准化后的数据。

图 3：在成像标准化工作流程中，三种不同的细胞系以不同密度接种。标准化处理后，细胞能量表型的离散程度显著降低。

2. 基于流式细胞术的能量代谢检测均一化工作流程

对于悬浮细胞体系，安捷伦的NovoCyte流式细胞仪具有独特的绝对计数功能，能够为Seahorse XF检测提供严谨的数据标准化操作。

工作流程概述：人外周血全 T 细胞解冻后，在培养基中孵育过夜。次日，使用抗 CD3/28 磁珠（磁珠与细胞比例为 2:1）激活细胞。每个样本的细胞悬液与 50 μL 活细胞染料（如 DAPI 或 7-AAD）混合，混合过程可在试管或 Agilent 96 孔圆底板（货号 204600-100）中操作，以计数 50 μL 细胞。调整细胞体积至每孔 100,000 个细胞，共 6 孔。将细胞转移至锥形管中铺板，200×g 离心后加入温热的 Seahorse XF 培养基，再次计数确认接种浓度。检测过程中进行最终计数，生成标准化数值。

图 4：通过流式细胞术工作流程对细胞进行标准化处理，显著降低了悬浮细胞培养中细胞接种引起的总体变异性。这使得动态 OCAR 测量更加准确，并能够更精确地评估精氨酸预处理的 T 细胞在糖酵解与线粒体 ATP 生成之间的代谢转换。

结论：

安捷伦开发并优化的两套能量代谢数据标准化的流程，能够帮助研究者校正外部因素导致的误差，提高细胞能量代谢数据准确性和实验重复性，促进对代谢机制的理解，并支持疾病诊断与治疗。进行数据标准化是为了消除细胞数量差异的影响，增强数据可比性和可靠性，便于大规模数据分析。这两套方案分别适用于贴壁和悬浮细胞体系，是经过多次验证且非常准确的归一化方法。

基于安捷伦BioTek Cytation1/Cytation5成像解决方案

 BioTek Cytation 作为Seahorse XF 能量代谢的成像归一化系统，完美匹配Seahorse XF检测板特殊的底部结构，针对8孔，24孔及96孔板均有自动化成像方案，确保获得每个样本孔内清晰的图像结果用于后续计数和统计分析。

 Cytation1和Cytaiton 5的高对比度成像模式能够提供Seahorse XF检测前细胞无标记成像结果，用于细胞质控；同时荧光成像模式支持XF分析流程结束后的细胞核成像计数用于数据标准化。

 此工作流程是活细胞水平非侵入分析，成像结束后，样本仍然可以用于其他分析，比如蛋白质分析或者免疫荧光染色，获得多维度数据结果。

基于安捷伦NovoCyte流式细胞仪解决方案

基于流式细胞术的标准化工作流程在中速和快速采集速率下均能产生准确的细胞计数数据，且变异系数低，有可能节省采集时间。

参考文献

1: Kam, Y., Chadwick, K., Jastromb, N., & Dranka, B. P. (2018). XF Data Normalization by the Agilent Seahorse XF Imaging and Normalization System. Application Note: 5994-0022EN

2: Wang, G. (Grace), Pillai, R., & Romero, N. (2023). Using the Agilent NovoCyte Flow Cytometer for Immune Suspension Cell Normalization in Agilent Seahorse XF Assays. Application Note: 5994-6245EN