Flk-1基因敲除嵌合小鼠模型中驻留巨噬细胞的衍生与肿瘤微环境构建研究

本研究通过囊胚互补技术构建Flk-1敲除嵌合小鼠模型，成功实现血管内皮细胞(VECs)、造血细胞和组织驻留巨噬细胞的供体源性重建，并证实该模型可形成供体来源的肿瘤微环境(TME)，为未来构建人源化肿瘤模型奠定基础。研究人员解决了传统人源化小鼠模型无法完全重建TME的难题，发现肿瘤浸润CD8+T细胞在嵌合体中保持正常细胞毒性活性，为抗癌药物临床前研究提供了新工具。

　　

在肿瘤生物学研究领域，肿瘤微环境(TME)的复杂性一直是制约治疗效果的瓶颈。传统的人源化小鼠模型虽能移植人类肿瘤细胞，却难以完整重建包含血管内皮细胞、免疫细胞等关键组分的TME。这一局限性导致许多在动物模型中有效的抗癌药物最终在临床试验中折戟沉沙。更棘手的是，组织驻留巨噬细胞这类具有自我更新能力的特殊免疫细胞群体，通过常规造血干细胞移植几乎无法实现供体替代。

为解决这一难题，日本筑波研究所（Tsukuba Research Laboratories, Eisai Co., Ltd.）的研究团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究。他们创新性地采用囊胚互补技术，将表达H2B-AG标记的C57BL/6小鼠胚胎干细胞(ESCs)注入经CRISPR-Cas9敲除Flk-1基因的ICR小鼠囊胚，成功构建了具有完整供体源性TME组分的嵌合小鼠模型。这项研究不仅证实了Flk-1缺陷背景下供体细胞对血管系统和免疫系统的全面重建能力，更首次展示了组织驻留巨噬细胞（包括小胶质细胞）在嵌合体中的成功互补。

研究团队运用了多项关键技术：通过CRISPR-Cas9系统构建Flk-1敲除胚胎；采用H2B-AG荧光标记实现供体细胞追踪；利用流式细胞术(FCM)和质谱流式技术(CyTOF)分析细胞来源；通过免疫荧光染色观察组织分布；使用MC38结肠癌细胞株建立肿瘤模型评估TME功能。实验所用嵌合小鼠均通过基因测序验证Flk-1敲除状态。

【生成嵌合小鼠模型】
研究人员通过电穿孔将Cas9蛋白和靶向Flk-1起始密码子的gRNAs导入ICR小鼠受精卵，随后注入H2B-AG标记的B6 ESCs。从494个移植胚胎中获得83只幼鼠，其中6只表现出近乎100%的供体源性外周血白细胞(PBLs)，经测序证实为Flk-1功能缺失突变。这些"PBL互补型"嵌合鼠的骨髓造血干细胞(KSL群体)也完全来源于供体。

【血管系统重建】
免疫组化显示，PBL互补型嵌合鼠的肾脏、大脑、胰腺等多器官血管内皮细胞(CD31⁺)均呈现H2B-AG阳性。质谱流式分析进一步证实，肿瘤组织中的新生血管内皮细胞完全由供体细胞构成，这与传统人源化模型形成鲜明对比。

【驻留巨噬细胞衍生】
研究取得突破性发现：小胶质细胞(Iba1⁺/CX3CR1⁺)、肝脏Kupffer细胞、胰腺CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞和肺CD64⁺CD11c⁺肺泡巨噬细胞在PBL互补型嵌合鼠中均实现供体源性重建。这解决了传统移植模型无法替代组织驻留巨噬细胞的难题。

【肿瘤微环境构建】
将B6源性的MC38结肠癌细胞移植至嵌合鼠后，质谱流式分析显示肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤血管内皮细胞(TECs)均主要来源于供体。特别值得注意的是，嵌合鼠肿瘤中CD8⁺T细胞的颗粒酶B表达水平与野生型B6鼠相当，证实其细胞毒性功能完好。

这项研究的意义深远。首先，它验证了通过Flk-1敲除囊胚互补技术构建供体源性TME的可行性，为开发更精准的人源化肿瘤模型奠定基础。其次，首次证实了组织驻留巨噬细胞可在嵌合体中实现供体替代，这对研究肿瘤免疫中两类巨噬细胞（驻留型与单核细胞衍生型）的不同作用提供了独特工具。最后，该模型保留了免疫细胞功能完整性，相比现有的人源化小鼠更能模拟人类免疫应答。尽管目前种间嵌合体构建仍面临挑战，但这项研究为未来开发"全人源化"TME模型指明了方向，将显著提升抗癌药物临床前评估的预测价值。