田间适用型一体化试剂盒的研发：快速检测植物和木虱中“Candidatus Liberibacter asiaticus”的新方法

为解决柑橘黄龙病（HLB）田间检测技术特异性不足、成本高且操作复杂的问题，研究人员开发了基于nrdB基因（五拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基）的探针重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，并组装成一体化试剂盒。该试剂盒特异性强、灵敏度高（检测限2 CLas细胞/μL），可配合粗提DNA在42℃、20分钟内完成检测，对998份植物样本和363只木虱的检测准确率与qPCR相当（P>0.05）。该成果为HLB防控提供了经济、高效的现场检测方案，发表于《Phytopathology Research》。

　　

柑橘产业正面临一场由“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）引发的毁灭性危机——黄龙病（HLB）。这种通过亚洲柑橘木虱（ACP）传播的韧皮部限制性细菌，已在中国10个省份摧毁超5000万株柑橘树。传统检测依赖实验室PCR，但CLas在植物体内分布不均、潜伏期长，且田间缺乏既灵敏又便携的检测手段。现有免疫试纸条特异性差，而LAMP（环介导等温扩增）和CRISPR/Cas12a联用技术虽灵敏却成本高昂。面对这一困境，西南大学柑橘研究所的研究人员将目光投向CLas基因组中稳定性更高的五拷贝nrdB基因，开发出可冻干保存的一体化RPA试剂盒。

研究采用粗提DNA结合实时荧光检测技术，主要技术路线包括：1）基于16株CLas菌株nrdB基因保守区设计RPA引物/探针；2）优化反应温度（32-52℃梯度测试）；3）通过质粒稀释（10^-1-10^-8）确定检测限；4）用998份柑橘样本和363只木虱验证实用性；5）组装冻干试剂盒并对比实时仪器与便携检测器性能。

特异性与灵敏度验证
温度梯度实验显示42℃时荧光信号最强（图2a），且仅对CLas阳性样本有响应（图2b）。灵敏度达10^-6稀释度（图2c），比常规PCR高100倍，与qPCR相当。质粒实验证实最低可检测2 CLas细胞/μL（图2d）。

田间适用性评估
植物样本检测中，RPA阳性率45.8%（457/998），与qPCR（46.4%）无显著差异（P=0.77）（图3b）。木虱检测阳性率27.8%（101/363），同样与qPCR结果一致（图3d）。冻干试剂盒对粗提DNA的检测一致性达100%（附图S3），且单只木虱检出率比PCR提高71%（12/58 vs 7/58）（附图S4）。

这项研究突破性地将多拷贝nrdB基因的稳定性与RPA的快速性相结合，解决了田间检测的三大痛点：1）冻干试剂盒可在室温保存一周，省去冷链运输；2）粗提DNA直接上样，避免纯化步骤；3）成本仅为实验室检测的25%。正如作者Fu SM等强调，该技术为新兴疫区的大规模筛查提供了“随时可用”的解决方案，其模块化设计更可适配其他便携设备，推动HLB防控从“被动应对”转向“主动预警”。