GH15家族α-葡萄糖苷水解酶同源物——右旋糖酐糊精酶(Ddase)的反式糖基化结构基础与催化机制解析

本研究解析了右旋糖酐糊精酶(Ddase)的晶体结构，揭示其与GH15家族异构化水解酶的结构相似性，通过生化实验证实Glu671和Glu858分别作为酸/碱催化剂和亲核催化剂的双置换机制，阐明了同一GH家族中保留型与异构化酶催化残基空间排布的差异机制，为糖基转移酶理性设计提供新见解。

　　

在食品和制药工业中，由α-(1→6)糖苷键构成的右旋糖酐(Dextran)是一种重要的细菌胞外多糖，传统上由右旋糖酐蔗糖酶(DSase)从蔗糖合成，但其理论最大产率受限于果糖基利用率。相比之下，右旋糖酐糊精酶(Ddase)能以α-(1→4)葡聚糖为底物实现更高产率，但其结构-功能关系长期未知。更引人注目的是，尽管Ddase与糖苷水解酶15家族(GH15)的异构化酶(如葡糖淀粉酶、异麦芽糖葡糖水解酶)具有序列相似性，却能催化保留型反应，这种机制矛盾成为糖生物学领域亟待解决的谜题。

日本北海道大学(Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University)的Takayoshi Tagami团队通过多学科方法揭示了这一机制。研究人员首先克隆获得Gluconobacter oxydans的Ddase基因(1,284个氨基酸)，发现其C端区域与GH15水解酶有44%同源性。截断实验确定最小活性单元Δ382C(1-902位氨基酸)，并通过硫单波长反常散射(S-SAD)解析其与假四糖抑制剂阿卡波糖的复合物晶体结构(分辨率2.5?，PDB 9JU0)。

关键技术包括：1) 构建系列N/C端截短体确定功能域；2) 硫单波长反常散射晶体结构解析；3) 定点突变结合动力学分析(G4和α-d-葡萄糖氟苷为底物)；4) 糖合成酶反应验证催化机制；5) 系统发育分析GH15家族进化关系。

结构分析揭示Δ382C为同源二聚体，每个单体含N1、N2和A三个结构域。其中A结构域呈现典型的(α/α)₆-桶状折叠，与GH15水解酶相似。令人惊讶的是，虽然催化残基Glu671(位于α5→α6环)与GH15异构化酶的通用酸催化剂空间位置完全一致，但对应通用碱催化剂的Glu858(位于α11→α12环)却更接近底物异头碳(距离缩短1.2-1.6?)。生化实验证实：E671Q突变体对α-d-葡萄糖氟苷(良好离去基团)的活性降低幅度小于对G4的幅度，表明Glu671作为质子供体；而E858A/S能利用β-d-葡萄糖氟苷进行糖合成反应，证实Glu858作为亲核试剂。

系统发育分析将Ddase归类于GH15家族的特殊分支，该分支特征性地含有：1) α9→α10环的Phe797-Tyr798二元体；2) α11→α12环的Gly857-Glu858二元体。研究还发现N1结构域(类似碳水化合物结合模块CBM35)虽不直接结合底物，但通过二聚体界面稳定催化域构象，特别是其β4→β5环与相邻亚基的α9→α10环形成氢键网络，间接调控Glu858的空间定位。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究首次阐明：1) GH15家族中存在通过催化残基微调实现保留型反应的亚类；2) 蛋白二聚化及N1结构域相互作用是维持催化残空间排列的关键；3) α11→α12环局部构象差异决定反应类型。该发现不仅破解了Ddase与GH15水解酶间的机制矛盾，更为设计新型糖基转移酶提供了"局部构象微调"的工程策略，对功能性寡糖的工业化生产具有重要指导意义。