共价靶向策略开发出首个LIMK1亚型选择性抑制剂及其在神经疾病治疗中的应用

本研究针对蛋白激酶家族中高度保守的LIMK1/2亚型选择性难题，通过共价靶向LIMK1特有的P-loop半胱氨酸(C349)，开发出首个细胞活性优异、选择性>30倍的LIMK1抑制剂SM311。该化合物展现出卓越的激酶组选择性，为研究LIMK1特异性信号通路及治疗脆性X综合征等神经疾病提供了关键化学工具。

　　

在蛋白激酶药物开发领域，针对高度保守亚型的选择性抑制始终是重大挑战。LIM激酶家族（LIMK1/2）作为调控肌动蛋白动力学的关键分子，两者激酶域序列相似度高达70%，但功能上存在显著差异：LIMK1与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关，而脆性X综合征（FXS）患者中异常激活的BMPR2-LIMK1通路更凸显其治疗价值。然而，现有抑制剂如LIMK-i3、TH257等均无法区分这两个亚型，严重阻碍了精准机制研究。

德国法兰克福大学药物化学研究所（Institute for Pharmaceutical Chemistry, Johann Wolfgang Goethe-University）的研究团队创新性地利用共价靶向策略，通过修饰已知pan-LIMK抑制剂LIMK-i3的骨架，成功开发出首个选择性靶向LIMK1特有半胱氨酸(C349)的共价抑制剂SM311。这项突破性成果发表于《Journal of Medicinal Chemistry》，为解密LIMK1特异性生理功能提供了关键工具。

研究团队运用了多项关键技术：通过TR-FRET结合动力学分析筛选最佳先导化合物；利用质谱验证共价加合物形成；采用NanoBRET技术评估细胞靶标结合活性；结合DSF热稳定实验和化学蛋白质组学全面评估选择性；最后通过Western blot验证对下游cofilin磷酸化的调控作用。

结果与讨论
激酶抑制剂动力学研究
通过系统比较12种LIMK-i3衍生物的结合动力学，发现二氟甲基取代的9b具有最快结合速率（k_on=3.47×10⁶ M^-1s^-1）。值得注意的是，所有I型抑制剂的靶标停留时间（0.34-0.92分钟）显著短于II型抑制剂TH470（335分钟），这种快速解离特性为后续共价修饰提供了理想基础。

LIMK1选择性化学探针开发
晶体结构分析揭示，SM1-71共价抑制剂与SRC激酶的P-loop半胱氨酸结合模式启发了研究团队。他们选择中等活性化合物9d（EC₅₀=1.55 μM）为骨架，在对位引入丙烯酰胺弹头。质谱分析证实SM311能特异性修饰LIMK1（+432 Da），而对C349A突变体无作用。COVALfinder实验测得k_inact/K_I达6.95×10⁴ M^-1s^-1，半衰期4.08分钟。

细胞水平验证
在LN229胶质瘤细胞中，SM311在100 nM即可显著抑制cofilin磷酸化，且对LIMK2的抑制活性弱150倍（EC₅₀分别为45 nM和6.74 μM）。特别值得注意的是，化学蛋白质组学实验显示SM311能特异性富集LIMK1而非LIMK2，且主要脱靶仅涉及CDKL2（EC₅₀=1.51 μM）。

结论与意义
该研究通过创新性的共价靶向策略，成功突破LIMK1/2亚型选择性难题。SM311作为首个细胞活性优异的LIMK1选择性探针，不仅为解析LIMK1在神经突触可塑性中的特异性功能提供了关键工具，更为治疗FXS等疾病提供了潜在先导化合物。其设计策略——即利用中等活性化合物结合快速解离动力学，通过共价修饰实现选择性——为其他激酶亚型选择性抑制剂开发提供了重要范式。研究人员同时开发的阴性对照化合物16（EC₅₀>25 μM）进一步确保了研究可靠性。这项研究将推动针对肌动蛋白调控异常相关疾病的精准治疗发展。