卵母细胞纺锤体蛋白质组学揭示Ccdc69通过"紧箍咒"机制调控纺锤体组装

本研究针对卵母细胞减数分裂中纺锤体蛋白组成不清的问题，通过高灵敏度质谱技术首次绘制了小鼠MI/MII期纺锤体蛋白质组图谱，鉴定出微管相关蛋白Ccdc69通过调控RanGTP通路和Aurka磷酸化影响纺锤体组装，其功能类似《西游记》中"紧箍咒"机制。该发现为理解女性生殖细胞染色体分离异常提供了新视角。

　　

在哺乳动物生殖生物学领域，卵母细胞减数分裂过程中的染色体精确分离是保障胚胎健康发育的关键。然而令人担忧的是，超过10%的人类卵母细胞存在染色体数目异常，且这一比例随母亲年龄增长显著上升。这种非整倍体现象与不孕症、流产和遗传疾病密切相关，其核心机制在于减数分裂纺锤体组装异常。不同于体细胞，卵母细胞的纺锤体形成不依赖中心体，而是通过特殊的无中心粒微管组织中心(aMTOCs)完成组装，但这一过程的分子调控网络仍存在大量未知。

中国科学院动物研究所的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》发表重要成果，通过创新性地分离小鼠卵母细胞减数分裂I期(MI)和II期(MII)纺锤体，采用高灵敏度timsTOF Pro质谱技术完成蛋白质组分析，鉴定出1817个纺锤体相关蛋白，并首次揭示卷曲螺旋结构域蛋白69(Ccdc69)通过独特机制调控纺锤体动态平衡。

研究主要运用了四项关键技术：1) 显微操作分离50个纺锤体/组的微量样本处理技术；2) 离子淌度质谱(timsTOF Pro)的高覆盖蛋白质组分析；3) CRISPR/Cas9基因敲除小鼠模型构建；4) 活细胞成像追踪Securin-mCherry降解动态。

Proteomic analysis of spindles in meiosis I and meiosis II oocytes
研究人员从MI和MII期卵母细胞中分别分离纺锤体-染色体复合体，通过质谱鉴定发现1015个共有蛋白和802个阶段特异性蛋白。GO分析显示这些蛋白主要参与微管相关过程、异染色质形成和纺锤体组织等生物学过程。特别值得注意的是，Ccdc69在卵母细胞中呈现高表达特征。

Depletion of Ccdc69 leads to elongated spindles in MI oocytes
通过构建Ccdc69基因敲除小鼠，发现缺失该蛋白虽不影响雌性生育力，但导致MI期纺锤体长度显著增加(0.3574±0.0045 vs 0.2768±0.0045)，提示Ccdc69可能参与维持纺锤体尺寸稳态。

Ccdc69 overexpression restricts spindle formation and polar body extrusion
过表达实验显示Ccdc69呈现剂量依赖性抑制效应：当注射mRNA浓度达1500 ng/μl时，纺锤体严重收缩(0.1370±0.0084)，87.14%的对照组卵母细胞能完成第一次极体排放(PBE)，而高剂量过表达组几乎全部阻滞(0.72%)。

Ccdc69 regulates microtubule formation by mediating Ran
免疫荧光追踪发现Ccdc69从GV期开始就环绕aMTOCs分布。过表达导致微管生成速率降低50%，Western blot证实Ran蛋白水平下降62.2%(1.00 vs 0.378±0.04)，但微管稳定性检测显示冷处理后的解聚率无差异，表明Ccdc69通过RanGTP通路调控微管生成而非稳定性。

Appropriate Ccdc69 preserves aMTOC distribution and spindle bipolarity
过表达造成aMTOCs无法向两极迁移，反而在微管球中心聚集。同时，Aurka磷酸化(p-Aurka)水平降低27.43%，其底物TPX2和TACC3的定位异常，导致80%的纺锤体失去双极性。

Excessive Ccdc69 perturbs kinetochore-microtubule(K-MT) attachment and SAC function
染色体铺片显示过表达组62%的卵母细胞出现染色体排列紊乱，K-MT错误连接增加2.3倍。延时成像证实Securin-mCherry降解延迟，表明纺锤体组装检查点(SAC)持续激活。

The C-Terminal coiled-coil domains of Ccdc69 are essential
结构域分析发现112-146和152-170位点的卷曲螺旋结构对Ccdc69功能至关重要，删除这些区域可使纺锤体长度和PBE率恢复正常。

这项研究首次系统描绘了卵母细胞减数分裂纺锤体的蛋白质组图谱，创新性地提出Ccdc69通过"紧箍咒"机制动态调控纺锤体尺寸的新概念：生理状态下适度限制纺锤体过度延伸，而过量时则通过抑制Ran和破坏p-Aurka/TACC3通路导致组装异常。该发现不仅为生殖细胞非整倍体形成机制提供了新解释，其建立的微量纺锤体蛋白质组学方法更为研究其他细胞器蛋白质组成树立了技术标杆。特别值得注意的是，研究揭示的Ccdc69剂量效应为理解女性年龄相关的生育力下降提供了潜在分子靶点，具有重要的转化医学价值。