基于聚焦声波技术的福尔马林固定石蜡包埋组织高通量蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析新策略

推荐：研究人员针对FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本蛋白质组分析中存在的去石蜡化效率低、覆盖深度不足等问题，开发了基于Covaris AFA超声裂解、S-Trap酶解和Orbitrap Astral DIA技术的自动化工作流程。该方案实现了单样本8,000-10,000种蛋白质和11,000个磷酸化位点的鉴定，定量CV<20%，为生物标志物挖掘和临床样本研究提供了高效解决方案。

　　

在生物医学研究中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本如同沉睡的宝藏库，保存着全球数亿份带有完整临床信息的病理标本。然而这些样本的蛋白质组学研究长期面临三大难题：传统二甲苯去石蜡化流程繁琐危险、蛋白质交联导致提取效率低下、质谱检测覆盖深度不足。尤其对于磷酸化修饰等翻译后修饰研究，FFPE样本的处理更是举步维艰，严重制约了从海量临床样本中挖掘分子机制的可能性。

针对这些挑战，Broad Institute of MIT and Harvard的研究团队在《Molecular 》发表了一项突破性研究。他们巧妙地将工业级声波聚焦技术引入生物样本处理，开发出首个可同时分析96个FFPE样本的高通量工作流程。通过Covaris Adaptive Focused Acoustics（AFA）超声系统实现无二甲苯去石蜡化，结合S-Trap微柱板式酶解和新型SDB-RPS除盐策略，配合Orbitrap Astral质谱的4 m/z窗口DIA（数据非依赖采集）技术，将单次运行的蛋白质鉴定数量提升至万级水平。

关键技术包括：（1）采用50%占空比的AFA超声联合90℃加热解除蛋白质交联；（2）优化S-Trap微柱板实现全组织消化；（3）建立自动化Opentrons OT-2机器人液体处理系统；（4）开发基于Terra云计算平台的MSFragger-DIA分析流程。研究团队在13例肺腺癌（LUAD）FFPE样本中验证了方案的临床适用性。

【Workflow and method optimization】
通过对比SP3磁珠与S-Trap微柱的消化效率，发现后者在2% SDS条件下肽段回收率提高2倍（图1C）。将超声占空比从25%提升至50%使蛋白提取量翻倍（图1B），而全组织消化策略显著增加了胶原蛋白等难溶组分的检出（图2C-D）。

【Application to macro-dissected tissue】
病理指导的宏观解剖（MMD）样本处理显示，无论干法或湿法保存，蛋白得率相当（图2B）。SDB-RPS除盐有效解决了色谱柱堵塞问题，使质谱连续运行时间延长3倍。

【Evaluation of quantitative accuracy】
在NCOA4过表达小鼠模型中，Astral DIA仅用24分钟梯度即鉴定9,900种蛋白质，与110分钟TMT方法的10,000种相当（图3B）。铁代谢相关蛋白Steap4和Tfr2的差异表达验证了数据的生物学相关性（图3F）。

【Semi-automated 96-well plate workflow】
临床LUAD样本分析鉴定到9,700种蛋白质和28,000个磷酸化位点（图4B,D）。磷酸化蛋白CTND1 Y257位点的异常激活揭示了MAPK通路在肺癌中的潜在作用机制。

这项研究的意义在于：首次实现了FFPE样本磷酸化蛋白质组的高通量分析，将单个96孔板的处理周期缩短至1周。创新的全组织消化策略突破了传统方法对难溶蛋白的检测瓶颈，而云平台数据分析流程使大规模临床研究成为可能。特别值得注意的是，该工作流程在20年前保存的乳腺癌样本中仍保持稳定性能，为回顾性队列研究提供了技术保障。随着Orbitrap Astral等新型质谱的普及，这种整合声学物理、自动化工程和云计算的多学科方案，或将开启临床蛋白质组学的新纪元。