新型凝血因子X变异体p.F139L的表征：杂合与复合杂合状态下导致出血倾向的分子机制研究

本研究针对罕见出血性疾病——先天性凝血因子X(FX)缺乏症，发现并深入表征了新型变异体p.F139L。研究人员通过多学科方法（包括凝血功能检测、基因测序、体外表达和结构分析）揭示该变异通过破坏EGF-2与蛋白酶结构域相互作用导致I型FX缺乏，为临床诊断提供新靶点，对指导携带者管理和抗凝治疗具有重要价值。

　　

凝血系统紊乱导致的出血性疾病一直是临床面临的重大挑战，其中先天性凝血因子X(Factor X, FX)缺乏症作为罕见的常染色体隐性遗传病，虽然发病率仅为百万分之一，但患者表现出从无症状到致命性出血的高度异质性。更棘手的是，约1/500的杂合子携带者也可能出现自发性出血或术后出血并发症，而现有诊断手段对这类轻度病例的检测灵敏度有限。尤其令人担忧的是，随着直接口服抗凝药(DOACs)的广泛应用，未被诊断的FX缺陷个体可能面临意外出血风险。这些临床痛点呼唤对FX变异机制的深入解析。

奥斯陆大学医学院临床医学研究所医学生物化学系（University of Oslo, Dept. of Medical Biochemistry, Institute of Clinical Medicine）的研究团队在《Thrombosis Research》发表的重要研究，首次报道了位于FX蛋白EGF-2结构域的新变异体p.F139L。通过分析两名分别携带杂合(p.F139L/wt)和复合杂合(p.F139L/p.E142K)变异的先证者及其家系，结合体外表达系统和结构生物学分析，揭示该变异通过破坏蛋白质折叠导致分泌缺陷的分子机制。这项研究不仅为临床诊断提供新标志物，更通过凝血酶生成实验证明其对全球止血功能评估的价值。

研究人员采用多维度技术路线：通过家系调查收集临床样本并实施ISTH-SSC出血评分；采用PT Quick、APTT等常规凝血试验结合FX活性(FX:C)和抗原(FX:Ag)检测进行表型分型；运用Sanger测序鉴定基因变异；利用计算机预测工具(SIFT/MutPred2等)评估变异致病性；建立HEK293T细胞表达系统比较野生型与变异型FX的分泌效率；最后通过PyMOL软件基于1XKA晶体结构解析变异的结构影响。

3.1 临床数据与实验室检测
先证者1(杂合p.F139L)表现为儿童期开始的鼻衄和创伤后出血，其子女FX:C为37-63 IU/dL，FX:Ag 30-51%，符合I型缺乏特征。先证者2(复合杂合p.F139L/p.E142K)出血评分达9分，表现出月经过多和术后出血，FX:C进一步降低至39 IU/dL。值得注意的是，p.E142K单杂合携带者(先证者2母亲)常规凝血参数正常但仍有轻度出血倾向，提示现有检测对部分变异灵敏度不足。

3.2 遗传分析
基因测序发现p.F139L(c.415T>C)为未见报道的新变异，而p.E142K(c.424G>A)在HGMD中记录为致病性变异但ClinVar存在争议。人群频率分析显示p.F139L在挪威人群中的等位基因频率达0.0016，提示可能存在奠基者效应。

3.4 凝血酶生成与TFPI
使用5 pM组织因子(TF)启动时，杂合个体的凝血酶峰值和ETP(内源性凝血酶潜能)显著降低，而1 pM TF条件下差异缩小。特别重要的是，p.E142K单杂合携带者尽管常规凝血指标正常，凝血酶生成仍明显受损，证明该方法对轻度缺陷检测的优越性。

3.5 体外表达实验
p.F139L变异体的分泌效率仅为野生型的1%，活性保留14%，而p.E142K相应值为13%和44%。当模拟杂合状态时，p.F139L使FX:Ag和FX:C分别降至15%和33%，而p.E142K影响较小(37%和80%)，这与临床观察到的表型梯度完美吻合。

3.6 结构分析
F139位于EGF-2与蛋白酶结构域界面，其苯丙氨酸侧链通过疏水作用稳定域间连接。突变为体积较小的亮氨酸可能破坏这种精密相互作用，导致蛋白质折叠异常。相比之下，E142K虽可能破坏与C129的氢键，但邻近二硫键(C129-C140)的保留减轻了其影响，这解释了p.E142K较温和的表型效应。

这项研究通过多学科交叉方法确立了p.F139L作为新型I型FX缺乏的致病变异，其临床意义体现在三方面：首先，该变异在挪威人群中的相对高频率(0.0016)提示需加强筛查；其次，凝血酶生成实验比常规检测更能识别p.E142K等轻度变异携带者；最后，结构解析表明EGF-2结构域对FX正确折叠的关键作用，为理解其它变异机制提供范式。特别值得注意的是，约30-50% FX活性的杂合个体仍可能出现需临床干预的出血事件，这挑战了既往认为56 IU/dL是安全阈值的观点，对围手术期管理和遗传咨询具有直接指导价值。未来研究可进一步探索p.F139L对FXa与组织因子途径抑制物(TFPI)相互作用的影响，以及其在DOACs治疗风险评估中的潜在应用。