蛋白质基因组学揭示肌层浸润性膀胱癌化疗耐药新机制：RAF家族蛋白与GSK3B-S9磷酸化的关键作用

本研究针对肌层浸润性膀胱癌(MIBC)化疗耐药难题，通过整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学多组学分析，系统解析了46例治疗前和14例治疗后肿瘤样本。研究发现RAF蛋白家族丰度和GSK3B-S9磷酸化水平可作为化疗敏感性标志物，同时揭示Wnt信号通路和JAK/STAT通路在耐药机制中的关键作用，为克服MIBC化疗耐药提供了新的治疗靶点和联合治疗策略。

　　

膀胱癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其中肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者预后较差。尽管以顺铂为基础的新辅助化疗(NAC)联合根治性膀胱切除术已成为标准治疗方案，但仅约25%患者能从中获益。更令人担忧的是，约50%接受NAC治疗的患者会出现化疗耐药，导致治疗失败。这种临床困境凸显了深入理解MIBC化疗耐药机制、寻找可靠预测标志物和开发新型治疗策略的迫切需求。

贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的研究团队在《Cell Reports Medicine》发表了重要研究成果。他们采用创新的蛋白质基因组学(proteogenomic)方法，对46例治疗前和14例治疗后MIBC肿瘤样本进行了全面分析，整合了全外显子测序(WES)、转录组测序(RNA-seq)、串联质谱标签(TMT)蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据。这项研究不仅揭示了RAF蛋白家族作为化疗敏感性新标志物的重要作用，还发现了通过抑制GSK3B和STAT3克服耐药性的潜在治疗策略。

研究采用了多项关键技术：1)多组学整合分析技术，包括全外显子测序和RNA测序；2)基于串联质谱标签(TMT)的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学；3)非负矩阵分解(NMF)聚类分析用于分子分型；4)SEPepQuant算法进行蛋白质异构体定量分析；5)使用DepMap数据库进行药物靶点优先排序。研究对象为45例接受新辅助化疗的MIBC患者，包括46例治疗前和14例治疗后配对的肿瘤样本。

蛋白质基因组学特征分析

研究首先对样本进行了全面的质量控制，确保肿瘤纯度达到80%以上。通过比较TCGA数据库，验证了本队列的突变谱和拷贝数变异(CNV)特征与大型队列的一致性。特别值得注意的是，蛋白质与mRNA表达的中位Spearman相关系数为0.485，证实了蛋白质水平调控的独立性。蛋白质数据在基因功能预测方面优于RNA数据，凸显了蛋白质组学分析的重要性。

多组学分型揭示化疗敏感性相关亚型

通过非负矩阵分解(NMF)对变异度最高的10%蛋白质和磷酸肽进行聚类，研究识别出4个特征明显的亚群。这些亚群不仅重现了已知的分子亚型，还与化疗敏感性显著相关。其中，Cluster 1和2主要包含管腔型肿瘤且对化疗敏感，而Cluster 3和4则与耐药性相关。蛋白质组学分型与RNA-based分型高度一致，但对代谢过程相关基因的分辨更为精细。

化疗耐药肿瘤的多组学分析

比较耐药与敏感肿瘤发现，上皮-间质转化(EMT)和肌肉生成(myogenesis)特征在耐药样本中显著上调，而DNA修复和G2M检查点相关蛋白在敏感样本中高表达。特别重要的是，GSK3B-S9磷酸化水平在敏感样本中显著升高，提示GSK3B活性抑制可能与化疗敏感性相关。

蛋白质异构体水平的化疗敏感性标志物

采用SEPepQuant算法发现了多个与化疗反应相关的蛋白质异构体。其中，ATAD1的短异构体(缺乏线粒体定位信号和跨膜结构域)在敏感样本中特异性高表达。更引人注目的是，RAF家族蛋白(ARAF、BRAF和RAF1)共有的激酶结构域肽段(SEPEP 3148_MG)在敏感样本中显著上调，这一发现通过稳定同位素标记平行反应监测(SIL-PRM)技术得到了验证。

ADC靶标的差异表达

研究系统评估了抗体偶联药物(ADC)靶标在MIBC中的表达模式。发现PD-L1(CD274)与TROP-2(TACSTD2)/NECTIN-4呈负相关，提示联合靶向这些分子可能产生协同效应。值得注意的是，神经元亚型肿瘤缺乏高表达的ADC靶标，这可能解释了该类肿瘤对现有ADC治疗反应不佳的原因。

治疗前后肿瘤的蛋白质基因组学比较

对8对治疗前后配对样本的分析显示，化疗后肿瘤表现出明显的溶酶体ATP酶上调和增殖相关基因(如MYC靶标)激活。尽管RAF1、GSK3B等蛋白总量变化不显著，但