GFP-on报告小鼠模型：实现体内基因编辑效率评估的新突破

本研究针对体内基因编辑递送载体效率评估的技术瓶颈，开发了携带可被腺嘌呤碱基编辑器(ABE)修复的EGFP无义突变的GFP-on报告小鼠模型。通过AAV9递送ABE8e-sgRNA系统，在成年和胎鼠中实现了跨组织、跨发育阶段的基因编辑可视化追踪，为优化基因治疗递送策略提供了高效平台。

　　

基因编辑技术正在彻底改变遗传疾病的治疗格局，但如何将编辑工具精准递送至目标细胞仍是重大挑战。传统评估方法存在周期长、成本高、分辨率有限等问题，特别是对于造血干细胞等稀有细胞群的编辑效率检测更是困难重重。更棘手的是，不同递送载体在体内外的表现往往存在显著差异，使得治疗方案的优化如同"盲人摸象"。

斯坦福大学医学院的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，创新性地构建了GFP-on报告小鼠模型。这种模型携带六个拷贝的EGFP基因，其中包含一个由胞嘧啶碱基编辑器(CBE)引入的Q81X无义突变（将谷氨酰胺密码子CAA突变为终止密码子TAA），该突变可通过腺嘌呤碱基编辑器(ABE)修复。研究人员采用双AAV9载体递送SpABE8e（化脓链球菌来源的ABE）和sgRNA，通过全身给药和宫内注射两种方式，实现了从单细胞到整体动物水平的编辑效率可视化评估。

关键技术包括：1）通过显微注射和回交获得纯合GFP-on小鼠；2）数字PCR定量EGFP拷贝数；3）体外电转验证sgRNA效率；4）双AAV9-SpABE8e-sgRNA1体内递送；5）流式细胞术和全组织荧光成像分析编辑效率；6）高深度测序验证编辑特异性。胎儿实验采用E13.5-E14.5宫内肝内注射。

结果

EGFP Q81X小鼠模型的建立

通过两轮BE4max-SpCas9-NG mRNA显微注射，成功构建了纯合GFP-on小鼠。数字PCR证实每个细胞含有6个EGFP拷贝，极大提高了检测灵敏度。模型验证显示所有组织均无EGFP泄漏表达，为编辑效率评估提供了"零背景"平台。

体外EGFP表达的恢复

筛选出效率最高的sgRNA1（编辑效率达50%），在c-Kit⁺骨髓细胞中实现98%的EGPF恢复。双AAV9在成纤维细胞中的转导效率为2.6%，与HTS测得的3.00±0.83%编辑率高度一致。CIRCLE-seq分析证实编辑系统具有高度特异性。

成年鼠体内EGFP突变的校正

联合视网膜后和股骨内注射（总剂量1×10¹² vg）后，肝脏中EGFP⁺细胞达17.5±2.9%，心脏编辑效率最高（21.3±5.4%）。全组织荧光成像显示AAV9的经典趋向性：脑、心、肝、骨骼肌等组织均有明显信号。六个月后仍可检测到持续表达，证实编辑的稳定性。

胎鼠宫内治疗的EGFP校正

宫内注射2.7×10¹⁰ vg双AAV9后，出生小鼠肝脏中EGFP⁺细胞达18%。免疫荧光证实编辑发生在肝细胞（HNF4A⁺）、神经元（NeuN⁺）和心肌细胞（laminin⁺）中。与成年模型不同，胎鼠骨髓中未检测到编辑，提示发育阶段影响AAV9的趋向性。

这项研究建立的GFP-on模型解决了基因治疗领域的三大关键问题：1）克服了传统Cre报告系统存在的泄漏表达问题；2）实现了单细胞分辨率下的编辑效率评估；3）兼容SpCas9、SaCas9（金黄色葡萄球菌Cas9）等多种编辑器。特别值得注意的是，六拷贝设计不仅提高了检测灵敏度，更真实模拟了临床治疗中需要编辑多等位基因的挑战。该模型为AAV衣壳优化、新型递送系统开发提供了标准化评估平台，将显著加速基因编辑疗法的临床转化进程。