USP1/UAF1通过外切机制靶向多聚泛素化PCNA并短暂富集单泛素化PCNA的分子机制研究

本研究揭示了USP1/UAF1复合物通过独特的外切机制(exo-cleavage)调控PCNA(增殖细胞核抗原)泛素化的分子机制。研究人员发现USP1/UAF1优先剪切K63和K48连接的多聚泛素链而非PCNA-泛素键，导致单泛素化PCNA(PCNA-Ub)的暂时性富集。通过冷冻电镜解析USP1/UAF1与K63-diUb复合物结构，结合动力学分析，阐明了该酶对DNA损伤耐受(DDT)通路平衡的调控作用，为癌症治疗靶点开发提供了新见解。

　　

在细胞应对DNA损伤的过程中，PCNA的泛素化修饰扮演着至关重要的调控角色。当复制叉遇到DNA损伤时，PCNA在K164位点的单泛素化(PCNA-Ub)会招募跨损伤合成(TLS)聚合酶；而进一步形成K63连接的多聚泛素链(PCNA-Ub_N)则启动同源重组(HR)介导的损伤旁路机制。然而，这两种修饰形式如何被精确调控以维持基因组稳定性，以及去泛素化酶USP1/UAF1在此过程中的具体作用机制，一直是领域内亟待解决的关键科学问题。

荷兰癌症研究所(Netherlands Cancer Institute)的研究团队在《Nature Communications》发表的研究成果，通过多学科技术手段系统阐明了USP1/UAF1对PCNA泛素化修饰的调控机制。研究人员综合利用冷冻电镜结构解析、酶动力学分析和功能实验，发现USP1/UAF1采用独特的外切机制选择性剪切多聚泛素链，这种特异性调控可暂时性富集PCNA-Ub，为理解DNA损伤耐受通路的选择提供了分子基础。

关键技术方法包括：构建多种泛素化PCNA工具蛋白(K63/K48连接的PCNA-Ub₂和PCNA-Ub_N)；荧光偏振分析酶切动力学；冷冻电镜解析USP1/UAF1与K63-diUb复合物3.0 ?分辨率结构；通过缺失突变和点突变分析功能域作用。

研究结果部分：

"USP1/UAF1 prefers to cleave K63- and K48-PCNA-Ub_N using exo-cleavage"：通过设计特异性泛素化PCNA底物，证实USP1/UAF1优先采用外切机制处理K63和K48连接的多聚泛素链，产生游离泛素而非完整链释放。

"Designing a global kinetic model"：建立全局动力学模型显示USP1/UAF1剪切泛素-泛素键的效率比PCNA-泛素键高10倍，解释了PCNA-Ub暂时富集现象。

"Structure of USP1/UAF1 in complex with K63-linked diubiquitin"：冷冻电镜结构揭示远端泛素定位于催化中心，近端泛素结合在USP1拇指区口袋，插入序列3与UAF1 WD40结构域相互作用维持活性构象。

"UAF1 plays a minor role in exo-cleavage preference"：UAF1的SLD和ancillary结构域通过空间位阻部分抑制内切活性，但外切偏好主要源于USP1自身特性。

"Hyperactivation of USP1 by mutating a conserved negative patch"：保守负电斑块(D172/E173)突变显著增强PCNA-泛素键剪切活性，说明进化保留亚优活性具有生理意义。

研究结论指出，USP1/UAF1的外切机制偏好使其成为PCNA泛素化状态的"分子过滤器"：既能防止PCNA被K48链标记降解，又可调控K63链介导的HR通路激活。这种独特机制在DNA损伤应答中形成时间调控窗口，当TLS无法完成损伤旁路时，持续积累的K63链最终触发HR修复。该发现不仅完善了对DNA损伤耐受机制的理解，还为开发靶向USP1的癌症治疗策略（如BRCA缺陷肿瘤的合成致死疗法）提供了理论依据。研究揭示的保守负电斑块调控机制，也为设计特异性USP1抑制剂开辟了新思路。