RalGAP肿瘤抑制复合体的结构与作用机制解析：揭示Ral GTPase调控新机制

本研究针对RalGAP肿瘤抑制复合体的结构未知问题，通过冷冻电镜技术首次解析了RalGAPα2/RGβ异源二聚体的58纳米长四聚体结构，揭示了β亚基"拥抱"结构域对催化活性的关键稳定作用，阐明了四聚体组装在体内功能的必要性，为癌症相关突变提供了结构基础。该成果发表于《Nature Communications》，为靶向Ral信号通路的抗癌策略奠定理论基础。

　　

在肿瘤发生发展中，Ral GTPases作为Ras信号通路下游关键分子，其异常激活与多种癌症密切相关。然而，作为负调控Ral活性的核心分子——RalGAP复合体的结构基础长期未知，严重阻碍了对其抑癌机制的深入理解。更棘手的是，约16%的子宫和皮肤癌患者存在RalGAP基因突变，但这些变异是否影响功能尚不明确。

德国明斯特大学（University of Münster）的研究团队通过冷冻电镜技术首次解析了人源RalGAPα2/RGβ复合体的高分辨率结构，发现这个肿瘤抑制因子竟以长达58纳米的"八字胡"状四聚体形式存在。研究显示，两个RalGAPα2/RGβ异源二聚体通过β亚基N端结构域头对头连接，形成具有两个活性中心的独特架构。令人惊讶的是，β亚基的"拥抱"结构域（hug domain）像脚手架般稳定α亚基的GAP催化域，这解释了为何RalGAP必须形成异源二聚体才能发挥功能。虽然四聚化在体外实验中不影响催化活性，但破坏该界面的突变体在小鼠胚胎成纤维细胞中完全丧失调控Ral活性的能力，表明四聚体组装对体内功能至关重要。

研究人员运用了三大关键技术：冷冻电镜单颗粒分析（分辨率达3.8?）解析四聚体结构；基于AlphaFold3的RalA-GAP复合物预测模型；建立RGβ基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞模型进行功能验证。通过HPLC检测GTP水解效率的体外活性实验，以及免疫共沉淀等生化手段系统验证了结构发现。

Structure and mechanism of the RalGAP tumor suppressor complex
冷冻电镜结构显示，RalGAPα2和RGβ通过尾部SD结构域形成异源二聚体，其核心是由5条β链组成的连续片层。引人注目的是，β亚基的伪GAP结构域（pGAP）因缺失催化性αC螺旋而丧失活性，但其"拥抱"结构域通过3923?²的界面与α亚基紧密结合。删除该结构域使复合体稳定性下降85%，证实其作为"分子胶水"的关键作用。

Comparison of a Asn-thumb GAP domain and a pseudo-GAP domain in RalGAP
通过AlphaFold3预测的RalA-GAP复合物模型显示，RalGAPα2的催化天冬酰胺（N1742）精确定位在RalA的GTP结合口袋，与RalA的Y43共同促进GTP水解。这解释了为何β亚基虽不直接接触RalA，却通过远距离稳定催化域维持活性。

The unique hug domain of RGβ contributes to catalytic activity through stabilizing effects
功能实验证实，仅含β-hug结构域（aa 973-1118）的截短体仍能恢复α亚基80%的GAP活性。这颠覆了传统认知——β亚基并非通过直接参与催化，而是作为结构支架发挥作用。

Tetramerization of RalGAP
结构分析发现，四聚体形成依赖于β亚基N端HEAT结构域的疏水界面（关键残基W65/V29/V33/V37）。将这些残基突变为亲水性氨基酸后，复合体长度从577?缩短至296?，但体外活性未受影响。

Formation of RalGAP tetramers via RGB dimerization is required for complex function
在RGβ敲除细胞中，四聚化缺陷突变体（RGβ^D4）完全丧失抑制Ral活性的能力，证实四聚体组装是体内功能的前提条件。研究人员推测这可能是亚细胞定位或调控所需的"分子尺"结构。

Structural analysis suggests pathogenicity of RalGAP variants identified in cancer patients
对TCGA数据库中32种癌症的突变分析显示，位于β-hug界面（如R1738H）或四聚化界面的变异可能破坏复合体功能。特别值得注意的是，神经发育障碍患者发现的N1076S突变（对应RalGAPα2的N943）位于hug结合位点，通过破坏局部结构导致疾病。

这项研究首次揭示RalGAP复合体的精密架构，阐明了其"双重锁钥"调控机制：β亚基既作为α亚基的"结构伴侣"，又通过介导四聚体形成实现功能调控。该发现为理解Ral信号过度激活导致的肿瘤侵袭性提供了结构框架，尤其为癌症相关变异的功能预测建立了评估标准。鉴于RalGAP在胰腺癌等多种肿瘤中表达下调，这些发现不仅填补了Ras信号通路的结构空白，更为开发靶向RalGAP四聚化界面的抗癌药物指明了新方向。正如研究者所言，这项工作"为系统分析RalGAP变异在肿瘤发生中的作用奠定了必要基础"。