基于人源丁酰胆碱酯酶改造的可卡因水解酶CocH3-Fc(M3)作为甲拌磷中毒医学对策的突破性研究

这篇研究报道了首个甲拌磷水解酶的发现——通过分子建模和体外实验验证，从人源丁酰胆碱酯酶(BChE)改造获得的可卡因水解酶CocH3-Fc(M3)对剧毒氨基甲酸酯类农药甲拌磷展现出显著催化活性：其结合亲和力(Ki=13.1μM)较野生型乙酰胆碱酯酶(AChE)提高4倍，双分子速率常数提升9-28倍。动物实验证实该酶能剂量依赖性地挽救致死剂量甲拌磷中毒小鼠，为反恐和公共卫生应急提供了创新性医学对策。

　　

Highlight
这项突破性研究首次报道了具有甲拌磷水解活性的工程酶，为应对这种被美国国土安全部列为"关注化学品"的剧毒物质提供了创新解决方案。通过理性设计获得的CocH3-Fc(M3)展现出卓越的解毒效能，标志着酶工程在反恐医学领域的重大进展。

材料与方法
CocH3-Fc(M3)蛋白通过我们先前构建的稳定CHO-S细胞系表达，使用含pCSC-CocH3-Fc(M3)质粒的pCSC-SP-PW慢病毒载体（质粒12335）。细胞在Gibco FreeStyle? CHO培养基（含青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和L-谷氨酰胺8mM）中培养。种子细胞解冻后重悬于完全培养基，在125mL摇瓶中37°C、8%CO₂条件下以120rpm振荡培养，密度达到3×10⁶ cells/mL时转接种到1L培养系统。

分子建模启示
基于我们在可卡因水解酶(CocH)研发的成功经验，我们通过计算筛选发现CocH3与甲拌磷存在有利相互作用。如图2所示，甲拌磷与AChE（图2A）和BChE（图2B）具有相似结合模式：甲拌磷羰基氧与酶氧阴离子空穴形成两个氢键（与Gly118/Gly117和Ala201/Ala199的主链NH），甲氧基与Trp86/Trp82形成疏水接触。关键区别在于BChE活性中心更大的空腔允许甲拌磷甲基氨基更深入结合口袋，与Phe329和Tyr332形成π-阳离子相互作用，而AChE中相应位置被Tyr337占据。CocH3的A199S/F227A/S287G/A328W/Y332G突变进一步优化了结合口袋：Ser199缩短与甲拌磷羰基氧的距离（2.7?→2.5?），Ala227扩大空腔，Trp328增强疏水相互作用，这些特征共同促成更强的结合亲和力。

讨论
分子建模预测和体外实验证实，源自人BChE改造的可卡因水解酶CocH3-Fc(M3)对甲拌磷的结合亲和力(K_i=13.1±0.9μM)较既往报道的AChE和BChE(IC₅₀≈67μM)提高约4倍，与我们的计算预测一致。值得注意的是，Mulder和Bakker估算AChE与甲拌磷的双分子速率常数(k_i)为1.4×10⁵ M^-1min^-1，而我们测得CocH3-Fc(M3)的k_i值(1.25×10⁶ M^-1min^-1)提升近9倍，催化效率(k_cat/K_M=0.11 min^-1μM^-1)更达到AChE的28倍。这种显著优势使其能有效竞争性结合甲拌磷，保护内源性AChE免受抑制。动物救活实验的完美结果（100%存活率）验证了其作为医学对策的转化潜力。