农业丙环唑残留通过ERG11和外排泵过表达促进新型隐球菌三唑交叉耐药性研究

这篇研究揭示了农业三唑类杀菌剂丙环唑(propiconazole)在环境残留浓度下可诱导新型隐球菌(C. neoformans)对临床三唑药物(FLU/VOR/ITR/POS)产生交叉耐药性，其机制涉及ERG11靶基因和AFR1/2/3外排泵基因的过表达。该发现为环境真菌耐药性传播提供了重要证据，对临床隐球菌病防治具有警示意义。

　　

ABSTRACT
氟康唑(FLU)仍是隐球菌性脑膜炎巩固治疗的基石药物，但在撒哈拉以南非洲等地区，单药治疗导致的耐药性问题日益严重。除临床使用外，农业三唑类杀菌剂被怀疑是耐药性产生的重要驱动因素。本研究以丙环唑为代表，首次系统证实环境残留浓度的三唑类杀菌剂可诱导新型隐球菌产生临床三唑药物的交叉耐药性。

INTRODUCTION
新型隐球菌是导致隐球菌病的主要病原体，全球年新增病例约100万例，死亡率高达30%-70%。目前一线治疗方案依赖两性霉素B联合氟胞嘧啶，但受限于药物毒性和可获得性，FLU仍是最常用的巩固治疗药物。耐药机制主要包括：ERG11基因突变、异质性耐药、ERG11过表达以及ABC转运蛋白(AFR1/2/3)和MFS转运蛋白(MDR1)的外排泵过表达。值得注意的是，未接受三唑治疗的患者体内也分离到耐药菌株，暗示环境暴露可能是耐药性获得的重要途径。

RESULTS

Development of triazole resistance in C. neoformans following exposure to propiconazole in liquid media
在液体培养基中，6株敏感菌株经丙环唑梯度浓度(0.125-16 mg/L)诱导后，共获得8株耐药菌株。其中4株对FLU(MIC 16->32 mg/L)、3株对ITR(MIC 1-2 mg/L)、4株对POS(MIC 0.5-1 mg/L)产生耐药，所有菌株均对VOR(MIC 1-2 mg/L)耐药。

Triazole resistance in C. neoformans induced by residual propiconazole in soil
土壤实验显示，丙环唑在1、2、5、10 mg/kg处理组中的半衰期分别为28.9、36.5、43.3和53.3天。从处理土壤中分离到14株稳定耐药菌株，其数量与农药残留浓度呈正相关：1 mg/kg组2株、2 mg/kg组5株、5 mg/kg组4株、10 mg/kg组3株。值得注意的是，12株菌对VOR耐药(MIC 1-8 mg/L)，4株对FLU耐药(MIC 16-32 mg/L)，6株对POS耐药(MIC 0.5-2 mg/L)。

Hereditary stability of induced strains with triazole resistance
经15代无药传代后，3株菌(P1-3、S5-70-2、S10-84-6)保持稳定耐药表型，其中P1-3对FLU和VOR的MIC分别维持在16和1 mg/L，S5-70-2和S10-84-6还保持对POS的耐药性(MIC 0.5 mg/L)。

Potential mechanism of resistant C. neoformans strains
耐药机制分析发现：

1. 所有稳定耐药菌株均显著上调AFR1(1.86-9.40倍)和AFR2(4.42-10.86倍)表达
2. 菌株P1-3独特地同时过表达ERG11(9.48倍)和AFR3(25.97倍)
3. 未检测到ERG11基因突变

DISCUSSION
研究首次证实环境相关浓度(1-10 mg/kg)的丙环唑可通过双重机制诱导耐药：保守的AFR1/2外排泵激活提供基础耐药性，而ERG11和AFR3的协同过表达则赋予更高水平耐药。该发现为理解环境-临床耐药传播提供了新视角，建议将土壤耐药监测纳入三唑类杀菌剂使用规范，并探索轮作等农业管理措施以减少耐药性发展。

MATERIALS AND METHODS
实验采用CLSI M27-A4推荐的微量稀释法测定MIC，通过qRT-PCR分析基因表达，使用QuEChERS方法检测土壤残留。所有实验均设三次生物学重复，采用2^-△△CT法进行数据分析。