碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌中NmcA β-内酰胺酶的创新检测技术开发与机制研究

【编辑推荐】本研究针对碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）中罕见的可诱导型NmcA β-内酰胺酶，开发了表型双纸片协同试验（DDST）和环介导等温扩增（LAMP）基因检测技术。通过特异性识别blaNmcA基因和独特的D形抑菌圈现象，实现了对NmcA/IMI类碳青霉烯酶（Ambler A类）的高灵敏度（10-1 CFU/管）检测，为临床实验室提供了快速准确的解决方案。

　　

Development of phenotypic and genotypic methods for the identification of NmcA β-lactamases in carbapenem-resistant Enterobacter spp. and Klebsiella aerogenes

ABSTRACT
肠杆菌目细菌因获得碳青霉烯酶基因导致的碳青霉烯耐药已在全球范围内出现。阴沟肠杆菌复合体（ECC）虽通常携带染色体编码的可诱导Ambler C类β-内酰胺酶（AmpC），但对碳青霉烯类敏感。然而，研究发现NmcA碳青霉酶基因（唯一可诱导的Ambler A类）可整合至ECC染色体。本研究开发了双纸片协同试验（DDST）和环介导等温扩增（LAMP）方法检测NmcA。DDST通过将碳青霉烯（美罗培南）纸片与第三代头孢菌素（头孢泊肟）纸片中心间距20mm放置，观察到头孢泊肟纸片旁特征性D形抑菌圈。LAMP引物特异性识别bla_NmcA，检测限达10^-1 CFU/管，较PCR灵敏度提高100倍。这些方法在临床实验室中展现出高准确性、灵敏度和特异性。

IMPORTANCE
NmcA作为碳青霉烯耐药相关酶，其表达受NmcR转录调节基因调控。本研究开发的表型与基因型检测方法，通过DDST验证NmcA特有的诱导现象，并通过LAMP特异性识别bla_NmcA。这些方法对临床监测具有重要意义。

INTRODUCTION
肠杆菌属是引起医院感染的重要机会致病菌。所有菌株均携带可诱导染色体AmpC β-内酰胺酶基因，对青霉素和一、二代头孢耐药，但通常对碳青霉烯敏感。AmpC表达与肽聚糖循环系统相关，受AmpR（LysR家族转录调节子）、AmpD（胞质酰胺酶）和AmpG（跨膜渗透酶）复杂调控。碳青霉烯类、头霉素类和克拉维酸是强效AmpC诱导剂。

碳青霉烯耐药肠杆菌科（CRE）中，阴沟肠杆菌复合体（ECC）的耐药机制主要包括AmpC过表达联合外膜孔蛋白缺失，或获得碳青霉烯酶基因。NmcA作为染色体编码的A类碳青霉烯酶，在ECC中零星出现，其水解活性对碳青霉烯类尤为显著。NmcA是唯一表达受转录调节基因（NmcR）调控的可诱导碳青霉烯酶，其诱导机制与AmpC调控系统相似。

RESULTS
抗菌药物敏感性与分子特征
NmcA/IMI产酶菌对头霉素和美罗培南（MEM）高度耐药，但对哌拉西林和三代头孢敏感。多重DDST对NmcA/IMI产酶菌的鉴定准确率达98.8%，特征性表现为：头孢泊肟纸片旁D形抑菌圈（MEM诱导导致），以及MEM/APB（3-氨基苯硼酸）纸片抑菌圈扩大≥5mm。

DDST性能验证
使用MEM作为诱导剂替代头霉素时，NmcA产酶菌在头孢泊肟纸片旁形成独特D形抑菌圈（抑菌圈靠近MEM侧变平）。该现象源于MEM诱导的AmpC/NmcA过表达。值得注意的是，AmpD突变株NR3901因持续高产AmpC导致对多数β-内酰胺类药物耐药，无法形成典型D形抑菌圈。

LAMP检测效能
针对bla_NmcA设计的LAMP引物在63°C实现最佳扩增，16分钟内可检测10⁶ CFU/管。该方法对NmcA及高同源性IMI变体（IMI-2/16/18）的检测灵敏度达10^-1 CFU/管，且与KPC、NDM等其他碳青霉烯酶无交叉反应。

DISCUSSION
本研究首次将DDST应用于可诱导A类碳青霉烯酶（NmcA/IMI）的检测。D形抑菌圈的形成机制涉及：①MEM诱导AmpC过表达导致头孢泊肟耐药；②NmcA与AmpC共调控系统的协同作用。LAMP技术通过6条特异性引物（F3/B3/FIP/BIP/LF/LB）实现bla_NmcA的快速检测，其中IMI-5因F3引物3'端错配未被检出。

现有碳青霉烯酶表型检测方法（如mCIM）虽能筛查NmcA产酶菌，但NG-Test CARBA 5免疫层析试条对其呈阴性。本研究提出的"mCIM阳性+CARBA 5阴性+DDST/LAMP确认"策略，为罕见碳青霉烯酶的鉴别提供新思路。

局限性包括：①AmpD突变株鉴定困难；②不适用于无诱导型AmpC的IMI产酶大肠埃希菌；③对IMI-5等低同源变体检测受限。未来需扩大菌株验证范围并探索多重耐药菌的检测方案。

MATERIALS AND METHODS
使用NmcA产酶菌NR1491/NR3901作为参考菌株，评估86株肠杆菌科细菌（含KPC/NDM/IMP/OXA-48等产酶菌）。药敏试验采用CLSI M100标准，通过PCR和测序确认耐药基因。DDST采用MEM（10μg）、APB（300μg）、CLX（750μg）、SMA（3mg）和头孢泊肟（10μg）纸片，间距20mm。LAMP反应使用Eiken Chemical试剂盒，实时浊度仪监测扩增。

ACKNOWLEDGMENTS
感谢日本奈良医科大学的技术支持。本研究受JSPS KAKENHI（21K10403）资助。