中国云南地区库蠓分离四种血清型流行性出血病病毒及其在牛群中的感染特征研究

本研究首次从中国云南地区库蠓（Culicoides spp.）中分离出四种血清型流行性出血病病毒（EHDV-1、-5、-6和-7），通过系统发育分析揭示其与日本、澳大利亚毒株的亲缘关系。血清流行病学调查显示中老缅越边境地区牛群EHDV抗体阳性率达29.22%-58.86%，证实七种血清型病毒在亚太地区形成共同基因库。该研究为监测EHDV进化特征及跨境传播风险提供了重要数据。

　　

库蠓采集与病毒分离
2023-2024年间在云南景洪、芒市和师宗三地牛棚采集39,000只库蠓，经形态学鉴定涉及9个物种，其中台湾库蠓（C. tainanus）占比最高达26.15%。通过BHK-21和C6/36细胞培养，从台湾库蠓、Jacobson库蠓（C. jacobsoni）和Oxystoma库蠓（C. oxystoma）中成功分离出四株EHDV，经血清型特异性RT-qPCR鉴定分别为EHDV-1（JH24C022）、EHDV-5（SZ23C107）、EHDV-6（MS23C056）和EHDV-7（JH24C130）。

基因组特征解析
全基因组测序显示四株病毒长度19,300-19,364bp，GC含量41.93%-42.42%。所有片段5′端保守序列为GUUAAA，3′端为CUUAC。Seg-3编码的VP3蛋白氨基酸同源性达98.6%-99.8%，系统发育分析将其归类为"东部群"，与日本、澳大利亚毒株聚枝。值得注意的是，EHDV-1毒株JH24C022的Seg-8（NS2蛋白）与中国YNV/KM3毒株同源性仅69.2%，却与日本Kawanabe_525毒株达97.1%，提示可能发生基因重配事件。

血清流行病学调查
对云南10个县区3,460份牛血清检测显示，EHDV总抗体阳性率43.09%，其中勐腊县最高（58.86%），富宁县最低（29.33%）。中和试验发现七种血清型（EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10）在牛群中呈梯度分布：EHDV-6（32.1%）和EHDV-7（28.7%）为优势血清型，而EHDV-2和EHDV-8流行率最低。地理分布显示北回归线以南地区阳性率显著高于北部，与库蠓种群密度呈正相关。

公共卫生意义
该研究首次报道了中国EHDV-5毒株的分离，填补了自1977年澳大利亚和2016年日本报道后的全球第三例空白。证实亚太地区EHDV存在活跃的基因交流，台湾库蠓等媒介在病毒自然循环中起关键作用。建议加强跨境动物疫病监测，特别是对高致病性EHDV-2和EHDV-8的防控。研究数据为制定区域性防控策略提供了分子流行病学依据。

技术亮点
采用FLAC技术（全长cDNA扩增）结合二代测序，克服了dsRNA病毒基因组测序难题；自主开发的C-ELISA检测方法灵敏度达1:16稀释度；通过Seg-2/VP2和Seg-6/VP5系统发育分析，建立了四簇分类法（Groups A-D），为EHDV血清型鉴定提供新标准。