哺乳动物肠道细菌生物量的绝对定量：基于宿主DNA读长归一化的宏基因组学新方法

【编辑推荐】本研究创新性地提出通过粪便宏基因组数据中细菌与宿主读长比值（B:H ratio）来估算肠道绝对细菌生物量，无需合成内标（spike-in）或流式细胞术等额外实验。该方法有效规避了粪便含水量、DNA提取效率等干扰因素，在抗生素治疗监测和疾病状态评估中展现出与qPCR、流式细胞术的高度一致性，为微生物组研究提供了简便可靠的新工具。

　　

引言

哺乳动物肠道是一个包含细菌、古菌、病毒和真核生物的复杂生态系统，其中细菌占粪便干重的25%-54%，密度高达10¹¹-10¹²个细胞/克。传统方法如流式细胞术、qPCR或合成内标（spike-in）虽能定量细菌生物量，但受粪便含水量、DNA提取效率等因素干扰。本研究提出通过宏基因组数据中细菌与宿主读长比值（B:H ratio）直接估算绝对生物量，无需额外实验。

方法学创新

核心假设是宿主DNA在粪便中的释放量相对稳定，可作为天然内标。通过比较B:H ratio与流式细胞术、qPCR等金标准，验证其在人类和小鼠粪便中的可靠性。实验数据来自MetaCardis队列（n=850）、Gut Puzzle队列（n=39）及公开数据集，涵盖健康人群、心血管疾病和炎症性肠病（IBD）患者。

关键发现

粪便含水量与生物量估算的干扰
流式细胞术测得的微生物负荷（microbial load）与粪便含水量呈显著负相关（R²=0.14, P<0.001），而B:H ratio与布里斯托粪便评分（Bristol score）无显著关联，表明其不受水分干扰。

宿主读长去除的稳健性
即使经过生物信息学宿主读长去除（host read depletion），B:H ratio仍保持高度一致性（Pearson r=0.94）。在Gut Puzzle队列中，宿主读长去除后人类读长比例显著下降，但B:H ratio前后相关性仍达0.94。

与替代方法的对比
在小鼠模型中，B:H ratio与qPCR测得的16S拷贝数高度一致（R²=0.656），且与基于饮食读长归一化（B:D ratio）的结果相当（R²=0.718）。牛奶宏基因组数据进一步显示，B:H ratio与合成内标归一化结果强相关（R²=0.784）。

疾病与健康应用

IBD中的生物量变化
iHMP2队列显示，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者的B:H ratio显著低于健康对照（P<0.05），且UC比CD更低，与肠道炎症程度一致。

抗生素干预响应
人类和小鼠抗生素治疗后，B:H ratio分别下降45倍和400倍，并在停药后迅速恢复。例如，12名人类受试者在给药第4天B:H ratio骤降，第8天即恢复基线水平。

讨论与展望

B:H ratio为微生物组研究提供了无需训练数据、兼容公共数据的轻量化解决方案。其局限性在于无法直接推算单个菌群的绝对丰度，且宿主DNA释放量的个体差异需进一步验证。未来可扩展至唾液、阴道分泌物等其他宿主样本的细菌生物量估算。

方法细节

数据处理采用定制化Nextflow流程，基于Kraken2和Bracken进行物种注释，人类基因组使用GRCh38参考序列。统计模型采用对数转换后的比值，ANOVA和Tukey事后检验分析组间差异，显著性阈值α=0.05。