甲基转移酶TRMT61A和NSUN2基因敲除对墨西哥利什曼原虫转录组及分化调控的影响

本研究针对利什曼原虫基因表达调控机制的关键问题，通过CRISPR-Cas9技术敲除m1A和m5C甲基转移酶TRMT61A和NSUN2基因，系统分析了其对墨西哥利什曼原虫分化过程和全局转录组的影响。研究发现这些甲基化修饰酶在寄生虫生命周期转换中发挥关键作用，显著影响表面抗原基因表达和核苷酸代谢通路，为理解表观转录组在寄生虫基因调控中的作用提供了新见解。

　　

在单细胞真核生物利什曼原虫中，基因表达调控主要依赖于转录后机制，这使其成为研究RNA修饰调控网络的理想模型。然而，目前对这类寄生虫中RNA化学修饰（如表观转录组）的功能认识仍然有限。特别是N¹-甲基腺苷（m¹A）和5-甲基胞嘧啶（m⁵C）这两种丰富的mRNA修饰，虽然在高等真核生物中已被证明参与翻译调控和mRNA稳定性维持，但在利什曼原虫中的生物学功能尚不清楚。

来自Aggeu Magalhaes研究所（Fiocruz Pernambuco）的研究团队针对这一科学问题，通过基因编辑和转录组学技术，系统研究了甲基转移酶TRMT61A和NSUN2在墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）中的功能。研究发现这些RNA修饰酶不仅影响寄生虫的分化过程，还全局调控包括表面抗原和代谢相关基因在内的多个功能类别基因的表达。相关成果发表在《Parasites》杂志。

研究人员主要采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TRMT61A单等位基因敲除（SKO）和NSUN2双等位基因敲除（DKO）的寄生虫株系，通过生长曲线、分化实验（包括前鞭毛体向无鞭毛体转化和成熟前鞭毛体形成）评估表型变化，并利用RNA测序技术分析全局转录组改变。功能富集分析揭示了受影响的生物学通路，同时通过MEME套件进行motif分析寻找调控序列特征。

研究结果部分包含以下重要发现：

背景：研究首先确认了墨西哥利什曼原虫中存在TRMT61A和NSUN2甲基转移酶的同源基因，其中NSUN2有两个旁系同源基因（LmxM.36.2170和LmxM.08.29.2540）。通过多次尝试发现TRMT61A双等位基因敲除不可行，提示该基因对寄生虫存活可能至关重要。

方法：成功构建的突变株系通过特异性PCR验证。生长曲线显示突变体在前鞭毛体阶段的增殖未受显著影响，但在分化能力上表现出明显缺陷：TRMT61A SKO和NSUN2 DKO突变体的成熟前鞭毛体形成率降低65%以上，而向无鞭毛体分化的进程则显著加快。

结果：转录组分析揭示TRMT61A部分敲除导致417个基因差异表达（239个上调，178个下调），NSUN2 2540 DKO影响221个基因（91个上调，130个下调），NSUN2 2170 DKO影响109个基因（54个上调，55个下调）。三组突变体共享43个下调基因和24个上调基因，表明这些甲基转移酶在功能上存在交叉调控。

功能分析显示TRMT61A缺失主要影响核苷酸代谢、翻译起始复合体（如eIF3多个亚基）和蛋白质折叠相关基因。NSUN2 2540缺失也影响了蛋白质折叠和核苷酸代谢通路，而其旁系同源基因NSUN2 2170缺失则更多影响DNA结合和核小体相关功能。值得注意的是，多个表面抗原基因（如PSA和GP63）在突变体中表达显著下调。

讨论与结论部分指出，这项研究首次系统揭示了m¹A和m⁵C甲基转移酶在利什曼原虫基因表达调控中的重要作用。这些酶通过影响特定mRNA的稳定性或翻译效率，进而调控寄生虫分化过程和表面抗原表达。研究发现TRMT61A和NSUN2可能通过不同的分子机制发挥作用，但又能协同调控部分共同靶基因。这些发现不仅拓展了对表观转录组在原生生物中功能的认识，也为开发针对RNA修饰过程的抗利什曼病新策略提供了理论依据。未来研究需要进一步明确这些甲基化修饰在寄生虫特定mRNA上的精确分布及其与RNA结合蛋白的相互作用机制。