Blastobotrys酵母基因组与分泌组分析揭示木聚糖降解关键酶GH11和GH30_7的木聚糖酶及其在生物质转化中的应用

本研究针对子囊菌酵母木聚糖降解系统研究不足的问题，通过整合基因组注释、生物信息学和分泌组分析技术，系统研究了三种Blastobotrys酵母在榉木葡糖醛酸木聚糖培养条件下的分泌机制。研究发现GH11家族木聚糖酶在木聚糖主链切割中起核心作用，首次在酵母中表征了具有葡糖醛酸木聚糖酶和木二糖水解酶双重活性的GH30_7木聚糖酶BmXyn30A，并揭示了GH11与GH30酶系的协同增效作用。该研究为开发高效木质纤维素生物精炼技术提供了新酶源和理论基础。

　　

在自然界丰富的木质纤维素资源中，木聚糖作为半纤维素的主要成分长期被视为"难攻克的堡垒"。这种由β-1,4-糖苷键连接的D-木糖骨架聚合物，不仅被乙酰化和阿拉伯糖基修饰，还常带有4-O-甲基葡糖醛酸侧链，形成复杂的空间屏障。更棘手的是，在植物细胞壁中，木聚糖像"分子盔甲"般包裹着纤维素纤维，严重阻碍纤维素酶的接触。虽然细菌和丝状真菌的木聚糖降解系统已有较多研究，但同样存在于多种木聚糖丰富生态位的子囊菌酵母却长期被忽视。

瑞典查尔姆斯理工大学（Chalmers University of Technology）工业生物技术系的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表的研究，首次系统揭示了Blastobotrys酵母属高效降解木聚糖的分子机制。研究人员采用PacBio长读长测序完成B.illinoisensis基因组组装（覆盖度345×，BUSCO完整性94%），结合比较基因组学和分泌蛋白质组学分析，发现三种Blastobotrys酵母（B.mokoenaii、B.illinoisensis和B.malaysiensis）在榉木葡糖醛酸木聚糖（GX）培养条件下，分泌组中GH11木聚糖酶占据主导地位。通过异源表达和酶学表征，首次在酵母中发现GH30_7家族酶BmXyn30A具有独特的双功能活性：既能特异性切割带有4-O-甲基葡糖醛酸取代基的木聚糖主链，又能将木四糖水解为木二糖（比活性5.08±0.17 μmol/min/mg）。酶组合实验显示GH11与GH30_7存在显著协同效应（p<0.05），为开发高效木质纤维素转化工艺提供了新思路。

研究采用的关键技术包括：①PacBio三代测序和BRAKER3基因注释流程；②基于SDS-PAGE和LC-MS/MS的分泌蛋白质组学分析；③重组蛋白在毕赤酵母中的异源表达和Ni柱纯化；④高效阴离子交换色谱（HPAEC-PAD）分析木寡糖产物；⑤DNS法和pNP底物法测定酶活动力学。

【基因组特征与比较分析】

通过PacBio测序获得B.illinoisensis高质量基因组（14.3Mbp，7个contigs），与B.mokoenaii（13.7Mbp）和B.malaysiensis（15.8Mbp）比较显示，三者平均核苷酸相似度（ANI）均<83%，确认为独立物种。CAZyme预测发现三株酵母均富含GH11、GH30_7、GH67等木聚糖降解相关酶系，其中B.mokoenaii的GH11木聚糖酶BmXyn11A与另两株同源酶序列相似性达87-90%。

【生长表型与酶活特征】

在含20g/L榉木GX的培养基中，三株酵母72h内OD₆₀₀均达8-11，分泌的胞外木聚糖酶活性在12h达到峰值。平板实验显示，B.mokoenaii和B.malaysiensis在木聚糖平板上形成明显水解圈，SDS-PAGE和酶谱分析证实其分泌组中21kDa蛋白（GH11）和50kDa蛋白（GH30_7）具有木聚糖水解活性。

【分泌蛋白质组学】

LC-MS/MS鉴定发现：B.mokoenaii分泌组中49%蛋白含信号肽，其中18%为CAZymes，包括GH11、GH30_7、GH3β-木糖苷酶和GH67α-葡糖醛酸糖苷酶；B.illinoisensis分泌组中40%蛋白含信号肽，但仅12%为CAZymes，其35kDa优势蛋白经鉴定可能参与细胞壁重塑而非木聚糖降解。

【GH30_7酶学特性】

重组表达的BmXyn30A最适pH5.0，在50℃保持稳定。HPAEC-PAD分析显示，与GH11产生短链木寡糖不同，GH30_7倾向于生成带有葡糖醛酸侧链的长链木寡糖。当与GH11以1:1摩尔比组合时，榉木GX水解产生的还原糖量增加13.3%（12.8mM vs 11.3mM），证实二者存在显著协同效应（p<0.05）。

这项研究首次系统阐明了Blastobotrys酵母通过"胞外GH11主链切割+GH30_7侧链修饰"的双引擎策略高效降解木聚糖的分子机制。GH30_7在酵母中的功能发现拓展了对真核生物木聚糖降解系统的认知，其独特的木二糖水解活性为定向制备功能性木寡糖提供了新工具。研究还揭示Blastobotrys酵母具有作为"细胞工厂"的双重优势：既能分泌高活性木质纤维素酶系，又能直接利用降解产物进行发酵，这种"一菌双能"特性可显著降低生物精炼过程的能耗和成本。该发现为开发第二代生物燃料和生物基产品的集成工艺提供了重要理论依据和技术支撑。