罗丹明B与SYTO 9双染技术在双光子成像中的生物安全性评估及ISO合规性验证

【编辑推荐】本研究首次通过ISO 10993和OECD TG 442E标准系统评估了920 nm双光子显微镜(TPM)下罗丹明B(RB)与SYTO 9双染体系的安全性，证实其在60 mW/cm2激光强度内无细胞毒性（存活率>70%）、无致敏性（CD54/CD86低表达）及皮肤刺激性（PII≤0.5），为临床转化提供关键安全阈值。

　　

Highlight

材料

RB（R6626，Sigma-Aldrich）和SYTO 9（S34854，Invitrogen）作为荧光探针用于实验。细胞活性通过CCK-8试剂盒（EZ-3000，Dojindo）检测，流式细胞分析采用Pacific Blue标记的小鼠同型对照抗体及人源CD54/CD86抗体。

非细胞毒性染料浓度确定

BJ成纤维细胞实验显示，RB浓度≤20 μg/mL时细胞存活率达90.66±7.57%（图2A），符合ISO 10993-5标准（存活率>70%）。浓度≥100 μg/mL时存活率骤降，确立20 μg/mL RB与2.7 μg/mL SYTO 9为安全窗口。

讨论

研究首次验证920 nm双光子激光联合RB/SYTO 9双染无显著生物风险：

1. 细胞水平：激光（6-60 mW/cm²）照射10分钟后，BJ细胞和THP-1细胞存活率均超70%阈值；

2. 免疫原性：h-CLAT试验显示CD54/CD86表达未达致敏阈值（MFI<200%）；

3. 动物模型：BALB/c小鼠皮肤组织学未见炎性浸润或结构损伤（PII≤0.5）。该成果填补了双光子成像临床转化的安全数据空白。

Conclusion

本研究确立RB/SYTO 9双染在60 mW/cm²激光强度下的ISO/OECD合规安全阈值，为活细胞成像、肿瘤微环境研究等应用提供标准化参考，推动双光子技术向临床诊断和术中导航的转化。