CRISPR/Cas9介导多基因突变创制无色透明罗非鱼模型及其在生物医学研究中的应用

为解决中等体型透明鱼类模型缺失的问题，西南大学研究人员通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑tyrb、csf1ra、pnp4a和tfec基因，成功培育出两种无色透明罗非鱼品系（amber和ruby）。该研究首次实现中等体型鱼类完全透明化，为活体成像、器官发育等研究提供了重要模型，成果发表于《New Biotechnology》。

　　

在脊椎动物研究中，体内器官的非侵入性观察一直是重大挑战。小型模式生物如斑马鱼虽具早期透明特性，但随着色素细胞发育会逐渐变得不透明。而中等体型鱼类因其更接近人类器官比例，在生物医学研究中具有独特优势，却始终缺乏有效的透明模型。这一领域空白严重限制了相关研究的深入开展。

西南大学生命科学学院/淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室的研究团队选择具有中等体型、繁殖周期短（14天）且基因编辑技术成熟的尼罗罗非鱼作为研究对象。通过系统分析发现，鱼体不透明主要源于四种色素细胞：黑色素细胞（melanophores）、黄色素细胞（xanthophores）、红色素细胞（erythrophores）和虹彩细胞（iridophores）。其中虹彩细胞因其全身广泛分布和高反光特性，成为透明化改造的关键障碍。

研究人员首先通过杂交获得tyrb^-/-;csf1ra^-/-双突变体，成功消除黑色素、黄色素和红色素细胞。随后采用CRISPR/Cas9技术分别敲除虹彩细胞关键调控基因pnp4a和tfec。研究发现：pnp4a突变仅能暂时消除早期虹彩细胞，后期会出现显著恢复；而tfec突变则导致虹彩细胞永久缺失，并意外发现该基因还影响黑色素细胞数量和形态。最终通过三重基因编辑，成功培育出两种透明品系——tyrb;csf1ra;pnp4a三突变的"琥珀鱼"（amber）和tyrb;csf1ra;tfec三突变的"红宝石鱼"（ruby），后者因tfec的持续作用能维持更长时间的透明度。

关键技术包括：1）多基因CRISPR/Cas9编辑系统构建；2）胚胎显微注射技术；3）基于限制性酶切的突变体筛选；4）全胚胎原位杂交技术；5）转基因荧光标记。所有实验动物均来自西南大学自繁群体。

研究结果揭示：

1. 双突变体表型特征：tyrb;csf1ra双突变完全缺失黑色素、黄色素和红色素细胞，但保留虹彩细胞导致不完全透明。

2. pnp4a基因功能：该基因对早期虹彩细胞发育至关重要，突变后胚胎期完全缺失虹彩细胞，但60日龄后出现组织特异性恢复。

3. tfec基因多效性：除消除虹彩细胞外，还显著减少黑色素细胞数量（减少约40%）并缩小色素细胞直径。

4. 透明品系比较：amber品系因虹彩细胞恢复在60日龄后逐渐失去透明度，而ruby品系可持续透明至120日龄，最终因肌肉增厚仅呈现半透明。

5. 生理指标分析：两种透明鱼生育力、存活率与野生型无显著差异，证实基因编辑未影响基本生理功能。

这项研究首次阐明：1）虹彩细胞是鱼类透明化的主要障碍；2）tfec具有调控多类型色素细胞发育的新功能；3）建立首个可育的中等体型透明脊椎动物模型。所创制的透明罗非鱼不仅为器官发生、肿瘤转移等研究提供可视化窗口，其约1500枚/次的产卵量更能满足大规模实验需求。该模型在药物筛选、发育生物学和教学示范等领域展现出重要应用前景，为脊椎动物研究提供了新的工具选择。