LaccID定向进化：一种新型细胞邻近标记和电子显微镜技术的多功能氧化酶

本研究针对现有邻近标记技术中过氧化氢(H2O2)毒性和空间分辨率不足等问题，通过11轮定向进化改造真菌漆酶，开发出新型酶工具LaccID。该酶利用氧气催化芳香底物氧化，成功实现活细胞表面蛋白质组图谱绘制和神经突触超微结构成像，为免疫突触研究和神经连接组学提供了突破性技术。

　　

在生命科学研究中，精确标记细胞表面蛋白和可视化亚细胞结构一直是重大挑战。传统邻近标记技术如APEX2和TurboID存在明显局限：前者需要有毒的H₂O₂作为辅因子，后者则因依赖ATP难以应用于细胞表面研究。更棘手的是，现有电子显微镜标记工具缺乏膜特异性，严重影响神经连接组学研究的准确性。

斯坦福大学（Stanford University）Alice Y. Ting团队通过创新性改造古老真菌酶，开发出革命性的LaccID技术。研究人员从担子菌PM1真菌的祖先漆酶LacAnc100出发，经过11轮酵母表面展示定向进化，最终获得的LaccID在哺乳动物细胞中展现出独特优势：既能利用氧气催化生物素化标记，又能特异性沉积DAB（3,3'-二氨基联苯胺）用于电镜成像。这项突破性成果发表于《Nature Chemical Biology》，为细胞生物学研究提供了全新工具。

关键技术包括：酵母表面展示定向进化筛选高活性突变体、串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学分析、基于Ce-DAB₂的电子显微镜标记技术。研究团队还建立了原代人类T细胞与黑色素瘤细胞的共培养系统，通过质谱鉴定出83个T细胞受体(TCR)激活相关表面蛋白。

工程化LaccID

通过比较四种真菌漆酶模板，选择祖先酶LacAnc100作为进化起点。酵母表面展示筛选获得7个关键突变，使LaccID在pH7.4的活性比模板提高20.8倍，热稳定性T₅₀提升3°C。独特的HCH基序（His450-Cys451-His452）构成电子传递通道，突变实验证实其必要性。

细胞表面特异性

与APEX2和HRP不同，LaccID在ER靶向时完全失活，仅在外膜保持活性。Western blot显示其选择性富集N-钙粘蛋白而非ER标志物钙网蛋白，这种特性源于铜伴侣蛋白的高尔基体定位和细胞表面更高氧浓度。

电镜应用突破

在果蝇神经系统中，神经元特异性表达的LaccID成功标记神经肌肉接头(NMJ)质膜。电镜显示其对比度显著优于APEX2，且无细胞内膜背景干扰，为神经环路重建提供理想工具。

T细胞表面组图谱

通过3:1共培养LaccID-T细胞与NY-ESO-1⁺黑色素瘤细胞，鉴定出CD69、LAG3等33个已知TCR激活标志物。意外发现线粒体蛋白 prohibitin 1(PHB1)可能通过磷酸化重定位至免疫突触，揭示了代谢与免疫信号交叉调控的新机制。

这项研究开创性地将漆酶引入细胞生物学工具库。LaccID的双重功能（无毒性邻近标记和膜特异性电镜标记）解决了领域内多年痛点，其应用将推动免疫突触、肿瘤微环境和神经连接组学研究。特别值得注意的是，该技术无需改造底物即可实现表面组特异性，相比需要BxxP（膜不透性生物素酚）的HRP方法更具普适性。未来通过哺乳细胞定向进化，可能进一步提升其活性，实现活体组织应用。