基于PNA-SERS生物传感器的唾液SARS-CoV-2基因组无标记检测技术研究

推荐：研究人员开发了一种基于肽核酸(PNA)探针和表面增强拉曼光谱(SERS)的无标记生物传感器，用于直接检测唾液中的SARS-CoV-2 RNA。该传感器采用硫醇化PNA探针固定于金纳米颗粒(AuNPs)修饰的玻璃基底，通过PCA和PCR分析实现110 pM的检测限，在模拟唾液中仍保持高特异性，为传染病即时诊断提供了新策略。

　　

在COVID-19大流行的背景下，快速、灵敏且无需复杂样本前处理的分子诊断工具成为迫切需求。传统蛋白检测方法存在分子特异性不足、光漂白等问题，而核酸扩增技术虽灵敏度高却操作繁琐。针对这些挑战，意大利国家研究委员会(CNR)下属肿瘤代谢与免疫内型研究所(Institute of Endotypes in Oncology, Metabolism and Immunology "Gaetano Salvatore")的Alessandro Esposito团队开发了一种创新性的无标记检测技术，相关成果发表在《Sensors and Actuators Reports》。

研究人员巧妙结合了肽核酸(PNA)的高特异性与表面增强拉曼光谱(SERS)的指纹识别能力。PNA作为DNA类似物，其中性骨架可避免静电干扰，且能抵抗生物酶降解；而金纳米颗粒(AuNPs)则提供了显著的信号增强效应。研究团队通过种子生长法合成50 nm AuNPs，经硅烷化处理固定在玻璃基底上，再修饰硫醇化PNA探针。检测时直接捕获靶RNA与探针杂交引起的振动模式变化，无需荧光标记或酶促放大。

关键技术包括：1) 优化AuNPs@glass基底的制备工艺，获得增强因子达2.9×10⁶的SERS活性基底；2) 设计靶向SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)的21-mer PNA探针；3) 采用主成分分析(PCA)和主成分回归(PCR)处理复杂光谱数据；4) 在模拟唾液(SSB)和缓冲液(HB)中验证性能。

研究结果显示：

1. SERS基底开发与表征：通过APES硅烷化修饰的玻璃基底实现了AuNPs均匀分布，BPT测试显示信号相对标准偏差<5%，证实基底具有优异的重现性。

2. PNA探针设计与优化：10 μM硫醇化PNA(序列：Cys-ATT AAA ACC TTC AAC ACC ATT)在预处理后形成单层自组装，717 cm^-1(腺嘌呤环伸缩)和770 cm^-1(胸腺嘧啶呼吸)等特征峰强度最高。

3. 检测灵敏度：在缓冲液中LOD达112 pM，模拟唾液中为220 pM。PCA分析显示510 cm^-1(嘧啶-嘌呤相互作用)和1373 cm^-1(C-N伸缩)等波段与浓度显著相关。

4. 特异性验证：单碱基错配序列和随机寡核苷酸的PC1得分与浓度无线性关系(p<10^-14)，而完全匹配靶序列呈现明显剂量效应。

这项研究的突破性在于：首次将PNA-SERS技术应用于唾液SARS-CoV-2直接检测，其灵敏度可覆盖感染早期病毒载量(≥10¹¹拷贝/mL)。相比需要扩增的qPCR或依赖抗体的免疫检测，该平台操作简便、成本低廉，且能区分单碱基变异。未来通过整合微流控等技术，有望开发成便携式诊断设备，为传染病防控提供新工具。研究也证实了多元统计分析在提升SERS检测可靠性方面的价值，为发展无标记分子诊断开辟了新途径。