CFTR通道抑制剂(R)-BPO-27的孔隙阻塞机制解析：为分泌性腹泻和ADPKD治疗提供新策略

本研究针对囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)过度激活引发的分泌性腹泻和常染色体显性多囊肾病(ADPKD)，通过冷冻电镜技术首次解析了CFTR与抑制剂(R)-BPO-27的2.1?高分辨率复合物结构。研究发现该化合物通过直接阻塞氯离子传导孔而非竞争ATP结合位点实现抑制，同时揭示了其结合依赖核苷酸结合域(NBD)分离状态的独特机制，为优化靶向CFTR的临床治疗策略提供了重要结构基础。

　　

囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)作为上皮组织电解质平衡的关键调控者，其功能异常与多种疾病密切相关。当CFTR功能缺失时会导致囊性纤维化(CF)，而过度激活则引发分泌性腹泻和常染色体显性多囊肾病(ADPKD)——前者是全球儿童死亡主因，后者是最常见的遗传性终末期肾病。虽然CFTR增强剂已成功用于CF治疗，但针对其过度激活的抑制剂研发仍面临机制不明的困境。(R)-BPO-27作为临床候选分子，虽在动物模型中显示出抗腹泻疗效，但其作用机制长期存在争议：既往假设认为其通过竞争ATP结合位点抑制通道活性，但缺乏直接证据。

为阐明这一关键科学问题，美国洛克菲勒大学的研究团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。通过整合冷冻电镜(cryo-EM)与电生理学技术，首次在原子水平揭示了(R)-BPO-27与CFTR的相互作用机制。研究发现该抑制剂通过独特的"孔隙阻塞"方式发挥作用，完全颠覆了传统认知，为靶向CFTR的药物设计提供了全新视角。

研究主要采用三项关键技术：1) 利用水解缺陷型CFTR(E1371Q)突变体进行2.1?冷冻电镜结构解析；2) 通过膜片钳技术测定抑制剂对氯离子流的动力学影响；3) 采用NADH偶联法分析ATP水解活性。人源CFTR蛋白在HEK293S GnTI细胞中表达，经PreScission蛋白酶切割和凝胶过滤纯化后用于结构研究。

结构揭示孔隙阻塞机制
冷冻电镜结构显示(R)-BPO-27结合于CFTR孔道的内侧前庭，其苯并嘧啶并吡咯并恶嗪二酮核心占据由TM1、TM6和TM12形成的极性空腔。关键相互作用包括：7'位羧酸盐与K95形成盐桥（突变实验证实该残基对抑制效能至关重要）；苯基和5-溴呋喃基团分别嵌入由P99/I34和F310/F311/L997/I1000/W1145组成的疏水口袋。这种结合模式完美解释了构效关系(SAR)数据——如(S)-对映体因5-溴呋喃空间位阻而失活。

功能与结构的矛盾统一
与传统竞争性抑制剂CFTR_inh-172不同，(R)-BPO-27在完全抑制氯电流时（1μM可使电流半衰期t_{1/2, inh}=12s）却不影响ATP水解最大速率（k_cat维持在26±2 ATP/蛋白/分钟）。这种"解耦"现象通过结构分析得到解释：抑制剂结合后虽然完全阻塞离子通路（孔隙探针显示1.7?通道中断），但NBD二聚体仍保持完整构象，ATP-Mg²⁺结合位点未受干扰。

动态结合的变构调控
通过比较WT、W401A（NBD二聚化概率50%）和E1371Q（稳定二聚体）三种CFTR变体，发现(R)-BPO-27结合速率与NBD二聚化概率呈负相关（t_1/2分别为8.3s、4.5s和230s）。这表明抑制剂需在NBD部分分离的过渡态才能进入结合位点，而结合后又通过稳定二聚体构象"锁定"抑制状态（恢复半衰期t_{1/2, rec}≈420s）。

这项研究从根本上改变了人们对CFTR抑制机制的理解：(R)-BPO-27代表了一类新型"孔隙阻塞剂"，其通过变构效应轻微提高ATP的K_m（从0.36mM升至1.8mM）而不影响k_cat，这种K型变构调控与cGMP对CAP蛋白的作用机制相似。相较于CFTR_inh-172（通过使选择性滤孔塌陷并降低k_cat72%来抑制），(R)-BPO-27提供了更精确的调控策略。该成果不仅为优化治疗分泌性腹泻和ADPKD的临床候选药物提供了结构模板，更开辟了通过靶向离子通道孔隙实现功能特异性调控的新途径。