冷冻电镜揭示M5毒蕈碱型乙酰胆碱受体的跨膜螺旋3/4界面变构结合位点及其选择性调控机制

本研究通过冷冻电镜技术解析了M5 mAChR与Gq蛋白及激动剂iperoxo的2.8?活性态结构，并发现选择性正变构调节剂VU6007678结合于跨膜螺旋3/4界面的新型变构位点。该研究首次完整揭示了mAChR家族的活性态结构特征，为神经系统疾病药物设计提供了精准靶点。

　　

在神经科学和药物研发领域，毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptors, mAChRs）家族一直是重要的治疗靶点。其中M₅亚型因其在脑血流调节和奖赏通路中的独特作用备受关注，但长期以来受限于其高度保守的orthosteric（正构）结合位点，开发选择性药物面临巨大挑战。虽然科学家们已发现多种M₅选择性正变构调节剂（positive allosteric modulators, PAMs），但这些化合物的结合位点始终未能明确，严重阻碍了基于结构的理性药物设计。

来自澳大利亚莫纳什大学（Monash University）的研究团队通过整合冷冻电镜、分子动力学模拟和药理学分析，成功解析了M₅ mAChR的活性态结构，并发现了一个前所未有的变构结合位点。这项发表在《Nature Communications》的研究不仅填补了mAChR家族结构生物学的最后一块拼图，更为开发治疗阿尔茨海默病、精神分裂症和缺血性卒中的新型药物提供了关键理论依据。

研究人员主要运用了四项关键技术：冷冻电镜单颗粒分析（分辨率达2.1?）、高斯加速分子动力学模拟（GaMD）、基于TrUpath平台的G蛋白激活检测、以及放射性配体结合实验。通过构建M₅/M₂跨膜区嵌合体突变株，系统验证了变构位点的功能重要性。

结构解析揭示活性态特征
通过工程化改造的M₅ΔICL3-mGα_q融合蛋白，研究人员首次获得了iperoxo结合的M₅ mAChR-G_q复合物结构（2.8?）。该结构显示激活态下TM6向外移动8.1?，TM7向内移动4.4?，形成了典型的"tyrosine lid"（酪氨酸盖）结构。与M₁-M₄亚型相比，M₅的orthosteric位点具有高度保守的芳香族残基网络（Y111^3.33, W455^6.48, Y458^6.51等），但Gα_q与Gα_i/o偶联亚型在α5螺旋插入角度上存在显著差异。

变构位点的发现与验证
当使用优化后的PAM VU6007678时，研究人员在TM3/TM4界面发现了一个全新的变构口袋（2.1?分辨率）。该位点位于细胞内端，由F130^3.52、R146^4.41等关键残基构成，通过π-π堆叠和氢键相互作用稳定配体。分子动力学模拟显示VU6007678能稳定ICL2的α螺旋构象，这种变构调控机制与已知的ECV（extracellular vestibule）位点PAMs截然不同。

功能决定因素解析
通过构建M₅/M₂跨膜区交换突变体，研究发现F130^3.52M突变完全消除了VU6007678的变构效应，而R146^4.41M突变则显著降低其功能调控能力（logβ=-0.7±0.3）。这些结果与结构观察到的相互作用完全吻合，证实该位点通过稳定DRY（D^3.49R^3.50Y^3.51）激活基序和G蛋白偶联界面发挥作用。

这项研究的意义在于：首次完整描绘了mAChR家族的活性态结构图谱；发现了一个可被理性药物设计利用的新型变构位点；揭示了PAMs通过稳定ICL2构象调控受体活性的新机制。特别值得注意的是，该变构位点与β₂AR的Cmpd-6FA结合位点空间位置相似但作用机制不同，为GPCR变构调控的多样性提供了新例证。研究人员指出，针对Y68^2.42（M₅特有残基）的化学修饰可能成为开发高选择性药物的突破口。这些发现不仅推动了神经精神疾病治疗策略的发展，也为理解GPCR的变构调控网络提供了重要范式。