斜入射反射差成像技术解析电活性细菌胞外电子传递通路的DET/MET分流机制

本研究针对电活性细菌胞外电子传递(EET)过程中直接电子传递(DET)与介导电子传递(MET)通路难以区分的科学难题，开发了基于聚苯胺(PANI)双电极耦合斜入射反射差(OIRD)成像的创新方法。通过PANI薄膜的电致变色特性将电荷信息转化为光学信号，首次实现了对Shewanella putrefaciens CN32细菌DET(47.93 fA/细胞)和MET(6.12 fA/细胞)电流的精准解耦测量，发现DET贡献占比高达88%。该技术为微生物燃料电池(MFC)优化设计提供了重要工具，发表于《Nature Communications》。

　　

微生物世界存在着令人惊叹的"生物电缆"现象——某些特殊细菌能够将代谢产生的电子传递到细胞外，这种被称为胞外电子传递(EET)的能力，让它们在环境修复和新能源开发领域大放异彩。然而科学家们长期被一个关键问题困扰：这些电子究竟是通过细菌表面的"分子导线"(直接电子传递，DET)还是借助分泌的"电子 shuttle"(介导电子传递，MET)完成传递？这两种通路的贡献如何量化？这个"黑白不分"的困境严重制约着微生物燃料电池(MFC)的性能优化。

传统电化学方法就像"盲人摸象"，只能检测混合电流信号。虽然显微技术能观察单细胞行为，却难以模拟实际MFC的工作状态。这个死循环直到中国的研究团队开发出革命性的光学-电化学联用技术才被打破。研究人员巧妙利用聚苯胺(PANI)薄膜的"电致变色开关"特性：在导电态时，它能接收细菌释放的所有电子；当被还原至绝缘态时，就迫使游离的电子 shuttle转移到邻近电极。配合斜入射反射差(OIRD)成像技术，首次实现了对电活性细菌"电子分流"过程的动态可视化。

这项研究的技术创新体现在三个关键环节：首先构建PANI-FTO双电极系统，通过电化学聚合制备具有纳米线网络的PANI薄膜；其次建立ΔI-Q定量关系模型，将光学信号精确转换为电荷密度；最后采用空间分辨OIRD扫描技术，实现全电极表面的实时电荷分布成像。实验选用模式菌株Shewanella putrefaciens CN32及其基因突变体作为研究对象，通过控制接种密度获得不同细胞覆盖率的生物阳极。

【OIRD响应与PANI还原的AI-Q相关性】

研究发现PANI薄膜在0.1至-0.05 V电位区间呈现线性ΔI-Q关系(ΔI=20.79*Q)，这种电致变色效应成功将电荷信息转化为光学信号。LSV测试显示PANI在-0.05 V完成从翠绿亚胺到全还原态的转变，此时导电性消失，为后续"电子开关"设计奠定基础。

【双电极上的EET行为解析】

创新设计的双电极系统(W1接种细菌/W2无菌)揭示出有趣现象：初期电子高度局域化在W1(ΔI下降速率6.54 μA/cm²)，60分钟后W2才开始接收外溢电子。电荷分布图显示边界区域电流密度更高，与细菌富集区吻合。

【PANI开关效应验证】

通过系列验证实验确认：当W1电位降至-0.3 V时，PANI完全失去电子接受能力，此时MET电流(0.74 μA/cm²)被迫转向W2。CV曲线证实FMN在还原态PANI表面无法发生氧化还原反应，证实了"电子阀门"效应。

【DET/MET电流定量】

关键实验数据显示，单个Shewanella putrefaciens CN32细胞的EET电流为54.05 fA，其中DET贡献47.93 fA(88%)，MET仅6.12 fA。对mtrC/omcA基因缺失突变体的检测进一步证实，外膜细胞色素同时影响两种传递途径。

【悬浮菌体的MET贡献】

引入纤维素膜分离技术后，量化发现悬浮细菌贡献32.5%总电流(1.21 fA/细胞)，显著低于贴壁菌的电子传递效率(54.35 fA/细胞)，为MFC的菌体固定化设计提供依据。

这项研究的意义在于建立了首个非侵入式的EET通路解析平台，其创新性体现在：空间分辨率达4 μm的电荷分布成像能力；单细胞水平的电流定量精度；真实模拟MFC工作状态的动态监测。研究发现DET是Shewanella菌株的主要电子传递途径，颠覆了早期认为MET主导的观点。技术推广性验证显示，该方法适用于S. oneidensis MR-1等多种电活性菌株，且对PANI膜厚具有良好耐受性。未来通过整合基因编辑技术，可进一步揭示EET通路调控的分子机制，为合成生物学改造电活性微生物提供新工具。这项发表于《Nature Communications》的工作，为生物电化学系统的基础研究和应用开发架起了一座精准测量的桥梁。