AAV8介导的Vglut3基因疗法实现成年聋鼠耳蜗快速听力恢复：首日见效的突破性研究

本研究针对遗传性听力损失中Vglut3基因突变导致的耳蜗突触传递缺陷，通过AAV8载体经后半规管(PSCC)递送Vglut3基因至成年Vglut3KO小鼠模型。研究发现基因表达24小时内即可检测到，听力功能在治疗后首日即开始恢复，5天达到野生型水平，揭示了耳蜗基因治疗前所未有的快速疗效，为遗传性耳聋的临床治疗提供了关键时间参数和机制见解。

　　

听力障碍作为全球最常见的感官缺陷之一，影响着超过4.66亿人，其中约50%-60%的先天性病例由基因突变引起。在遗传性耳聋中，内毛细胞(IHCs)与螺旋神经元(SGNs)间突触传递的缺陷日益被认为是导致听觉功能障碍的关键因素。Vglut3/Slc17a8基因编码的囊泡谷氨酸转运蛋白3(VGLUT3)负责将谷氨酸包装到IHCs的突触小泡中，该基因的突变会破坏IHC-SGN突触的谷氨酸释放，导致人类和小鼠模型出现严重的先天性耳聋。虽然人工耳蜗可以部分恢复听力，但无法解决潜在的生物学缺陷，这凸显了直接靶向突触功能障碍分子基础的治疗方案的迫切需求。

郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科的研究团队在《Molecular Therapy Methods》发表的研究中，系统性地探讨了成年Vglut3^KO小鼠在接受腺相关病毒(AAV)介导的内耳基因治疗后，耳蜗功能恢复的进程和空间分辨的转基因表达动力学。研究人员通过后半规管(PSCC)注射携带Vglut3的AAV8载体，在注射后1-14天评估听觉脑干反应(ABR)阈值和耳蜗转基因表达情况。

研究采用了多项关键技术：通过PSCC微注射进行AAV8载体递送；使用ABR检测评估听觉功能恢复；免疫荧光染色分析GFP和FLAG标记的转基因表达时空动态；全耳蜗成像技术定量分析荧光强度；以及自由场声学惊吓反应测试验证行为学恢复。实验使用4-5周龄的Vglut3^KO小鼠模型，通过对比治疗组与野生型(WT)及未治疗对照组的各项指标，系统评估治疗效果。

研究结果部分，"耳蜗AAV8-GFP表达的时空动态"显示，AAV8-GFP注射后1天即可在多个IHCs中检测到弱但明确的GFP表达，3天时信号显著增强并扩展至大部分IHCs，5天时在整个耳蜗(包括顶转、中转和底转)均观察到强烈的GFP表达。免疫荧光定量分析证实，与对照组相比，注射后1天耳蜗顶转、中转和底转的GFP荧光强度即出现统计学显著增加。

"AAV8-GFP注射保留急性期听觉功能和毛细胞完整性"部分证实，AAV8-GFP注射后1、3、5和14天的ABR阈值保持不变，表明AAV8-GFP递送耐受性良好，不会损害成年WT小鼠的听觉功能。全耳蜗制备的免疫染色显示，在所有检查时间点，内毛细胞和外毛细胞均保持完整，与对照组相比无显著毛细胞损失。

"小鼠耳蜗基因治疗后VGLUT3表达的时空动态"部分发现，AAV8-Vglut3-FLAG注射后1天即可检测到FLAG表达，随时间推移逐渐增加，14天达到峰值。与GFP类似，FLAG表达见于耳蜗顶转、中转和底转，不同区域表达起始无显著延迟。定量分析显示，注射后1天耳蜗中转的FLAG荧光强度即显著升高。

"Vglut3^KO小鼠基因治疗后听力阈值的时间变化"部分获得了最引人注目的发现：注射后1天ABR阈值即显著降低，表明听觉功能早期恢复。最快速的ABR阈值恢复发生在治疗后24-48小时内，治疗组Vglut3^KO小鼠在注射后2天的阈值较1天显著改善。到注射后3天，ABR阈值已显著接近WT水平，5天时完全恢复至WT水平。

"听力阈值与FLAG荧光强度的功能关系"分析揭示，随着治疗后时间增加，ABR阈值呈现显著下降趋势。回归分析显示，ABR阈值与治疗后天数呈强负相关(16kHz: y=-35.96ln(x)+73.392, R²=0.9881)。FLAG荧光强度与听力阈值之间存在明显的反比关系，Vglut3表达增加与听觉功能改善相关。

这项研究首次提供了内耳基因治疗后基因表达动力学和功能恢复的高分辨率时间线。研究发现转基因表达在注射后24小时内启动，最早在1天即可检测到听力恢复，挑战了功能恢复需要1-2周的传统范式。ABR阈值在5天时趋于稳定至WT水平，而FLAG标记的VGLUT3表达持续增加至14天，表明耳蜗基因治疗存在动态修复和维护两个不同阶段。非线性逆相关关系(y=104.29x^-2.242 at 16kHz)揭示了早期听力恢复对VGLUT3增量增加的 exquisite敏感性，为优化载体剂量和治疗窗口提供了定量框架。PSCC递送AAV8的安全性验证(无急性耳毒性或毛细胞损失)支持该途径的临床转化潜力。

这项研究通过前所未有的时间分辨率解析了耳蜗基因治疗的分子与功能恢复的协调进程，彻底改变了我们对耳蜗基因治疗的理解。首日治疗效应的发现使得能够快速筛选新型载体和给药方案，而非线性时间-反应关系为优化治疗疗效起始提供了定量框架。随着基因治疗向临床试验推进，这些见解将对弥合小鼠模型与人类遗传性耳聋有效治疗之间的差距发挥不可或缺的作用。