基因电转递送IL-12诱导损伤相关分子模式表达：黑色素瘤与结直肠癌细胞免疫激活新机制

本研究针对IL-12系统给药毒性问题，通过基因电转（GET）技术局部递送IL-12编码质粒，探究其对B16F10黑色素瘤和CT26结直肠癌细胞中损伤相关分子模式（DAMPs）及细胞因子的调控作用。研究发现IL-12 GET特异性上调IL-6和TNF-α等诱导性DAMPs（iDAMPs），揭示了GET触发多重免疫激活的分子机制，为优化IL-12肿瘤免疫治疗提供了新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，白细胞介素12（IL-12）因其强大的抗肿瘤效应备受关注——它能激活自然杀伤（NK）细胞和T细胞，诱导干扰素γ（IFN-γ）产生，并抑制肿瘤血管生成。然而临床应用中，IL-12的系统给药面临严重挑战：半衰期短、全身毒性大，甚至导致早期临床试验被迫终止。如何实现IL-12的精准递送，成为突破疗效瓶颈的关键科学问题。

来自斯洛文尼亚卢布尔雅那肿瘤研究所（Institute of Oncology Ljubljana）的Ajda Medved团队在《Biomedicine》发表创新研究，首次系统解析了基因电转（Gene Electrotransfer, GET）技术递送IL-12编码质粒时，肿瘤细胞内核酸传感器激活与损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns, DAMPs）表达的动态关联。研究人员选择B16F10黑色素瘤和CT26结直肠癌两种小鼠肿瘤细胞模型，通过qPCR、流式细胞术和多重蛋白检测等技术，揭示了GET介导的IL-12递送触发双重免疫激活机制：既通过外源核酸激活细胞质传感器，又通过IL-12蛋白诱导特异性细胞因子释放。

关键技术方法包括：1）使用Cliniporator?电穿孔系统进行质粒递送；2）通过Presto Blue?检测细胞活力；3）采用Bio-Plex多重免疫分析系统检测23种细胞因子；4）qRT-PCR分析核酸传感器及受体表达；5）ELISA定量IL-12 p70蛋白表达。

3.1 质粒转染效率
研究发现CT26细胞的EGFP转染效率（48小时达峰值）显著高于B16F10细胞，但两者在pmIL12 GET后均实现功能性IL-12表达，蛋白分泌高峰出现在24小时。值得注意的是，尽管转染率不足5%，仍可检测到显著生物学效应，证实GET在低转染效率下仍具治疗潜力。

3.2 细胞存活率
电穿孔（EP）本身导致B16F10细胞存活率降低24%，CT26细胞降低11%。而pmIL12 GET使两种细胞存活率分别降至26%和55%，表明黑色素瘤细胞对电穿孔更敏感。非编码质粒pScramble GET的细胞毒性与之相当，证实细胞死亡主要源于电穿孔而非质粒类型。

3.4 细胞质传感器激活
在黑色素瘤细胞中，DNA传感器Ddx60、Dai和p204 mRNA在pmIL12 GET后4小时显著上调；RNA传感器Mda5表达暴增80倍，Rig-I和Lgp2也有明显升高。结直肠癌细胞则呈现差异化响应：Dai和Ddx60在24小时达峰值，而RNA传感器激活延迟至24-48小时。这种时空调控差异提示肿瘤类型特异性的核酸识别机制。

3.5 细胞因子风暴
蛋白检测揭示关键发现：IL-12 GET特异性诱导IL-6和TNF-α（iDAMPs）表达，而其他细胞因子（如IL-1α、IL-10等）的升高是GET非特异性效应。值得注意的是，B16F10细胞中IFN-γ显著增加，而CT26细胞未见此现象，反映黑色素瘤对IL-12信号更敏感。

这项研究首次阐明IL-12基因治疗通过三重机制发挥抗肿瘤作用：1）直接产生IL-12蛋白激活免疫细胞；2）外源核酸触发细胞质传感器通路；3）诱导iDAMPs（IL-6/TNF-α）增强免疫识别。特别重要的是，研究发现即使低转染效率也能引发显著免疫应答，这对临床转化具有重要指导价值。Tanja Jesenko等通过精细实验设计，不仅证实GET是IL-12的安全递送平台，更发现iDAMPs可能是"冷肿瘤"免疫激活的关键开关，为联合免疫治疗提供了新靶点。该成果为克服IL-12临床应用障碍提供了理论依据，也为其他细胞因子基因治疗研究树立了机制研究范式。