综述：基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑非临床安全性考量

这篇综述深入探讨了CRISPR/Cas9技术在基因治疗中的非临床安全性挑战，系统梳理了从基因编辑机制（如NHEJ/HDR修复）、递送载体（AAV/LNP）到免疫原性（如抗Cas9抗体）等关键风险，并提出了基于动物模型和计算生物学（如gRNA设计工具）的解决方案，为临床转化提供了重要参考。

　　

基因组编辑技术的革命与安全挑战

近年来，CRISPR/Cas系统彻底改变了基因组编辑领域，为人类细胞和基因治疗产品开辟了新途径。这项源自细菌适应性免疫系统的技术，通过向导RNA（gRNA）和Cas蛋白的协同作用，实现了对特定DNA序列的精准切割。然而，在从实验室走向临床的过程中，非临床安全性问题成为亟待解决的关键瓶颈。

基因编辑工具的进化历程

从早期的锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN），到如今的CRISPR/Cas系统，基因编辑技术经历了显著变革。CRISPR/Cas9凭借其设计简便性和高效率成为主流工具，其核心组件包括识别靶序列的gRNA和产生双链断裂（DSB）的Cas9核酸酶。DSB随后通过两种主要途径修复：易错的非同源末端连接（NHEJ）和精确的同源定向修复（HDR）。

临床应用的突破与局限

截至2024年，全球已有68项CRISPR/Cas相关临床试验，主要集中在肿瘤学领域。值得注意的是，美国FDA已批准CASGEVY^?用于治疗镰状细胞病，这是CRISPR技术的重要里程碑。在肿瘤免疫治疗中，该技术被用于改造T细胞（如敲除PD-1基因）、CAR-T细胞（如制备通用型UCART19）以及NK细胞，显著增强了其抗肿瘤活性。然而，眼科疾病治疗试验EDIT-101的暂停也提示了疗效局限性的存在。

安全性风险的立体防控

1. 递送系统选择：病毒载体（如AAV5）与非病毒载体（如LNP）各具优劣。AAV虽然免疫原性低，但包装容量有限（仅4.5kb），而高剂量可能导致肝毒性。LNP递送的mRNA则能避免基因组整合风险。

2. 脱靶效应控制：通过高保真Cas9变体（如SpCas9-HF1）和改进的gRNA设计算法（如Sniper-Cas9），可将脱靶风险降至最低。

3. 免疫原性管理：约78%人群存在抗SaCas9 T细胞反应，可通过表位掩蔽或Gly-Ala重复序列修饰来规避。

4. 肿瘤igenicity防范：p53通路激活可能导致突变细胞阳性选择，需通过染色质状态分析和功能验证来预警。

未来发展方向

碱基编辑和prime编辑等新技术无需产生DSB，显著提高了安全性。同时，诱导多能干细胞（iPSC）分化的NK细胞疗法（如FT538）展现了规模化应用的潜力。监管方面，EMA和FDA均强调需采用"基于风险"（risk-based）的策略，结合GLP规范开展非临床研究。

随着CRISPR工具箱的不断完善，以及递送技术、免疫规避策略的突破，基因治疗正逐步跨越安全性的门槛，为遗传病、肿瘤等重大疾病的根治带来曙光。