酿酒酵母代谢工程改造实现新黄质高效合成：突破微生物合成瓶颈与抗氧化活性开发

本研究针对植物源新黄质(neoxanthin)提取效率低、季节性波动大的产业难题，通过创新性地组合代谢工程与酶工程技术，首次在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了完整的β-胡萝卜素-紫黄质-新黄质合成途径。研究人员通过筛选藻源紫黄质脱环氧酶(VDL1)截短变体、优化膜定位策略及脉冲补料培养，最终使新黄质产量达到0.7 mg/gDCW，创微生物合成最高记录，为这种具有抗癌和抗氧化活性的稀有类胡萝卜素工业化生产提供了新思路。

　　

在天然产物领域，类胡萝卜素因其独特的生物活性和商业价值备受关注。作为含氧类胡萝卜素的重要成员，新黄质(neoxanthin)展现出比β-胡萝卜素和叶黄素更强的抗氧化活性，能显著抑制前列腺癌细胞增殖，还是化妆品成分β-紫罗兰酮(β-damascenone)和岩藻黄质(fucoxanthin)的关键前体。然而传统植物提取法面临含量低(仅占类胡萝卜素总量的9-14%)、季节性波动大(含量变化达20-30%)等瓶颈，且有机溶剂提取工艺存在环境隐患。这些限制严重制约了新黄质的规模化应用，亟需开发可持续的微生物合成方案。

智利天主教大学的研究团队选择酿酒酵母作为合成底盘，通过系统代谢工程策略实现了新黄质的异源合成。研究首先构建了β-胡萝卜素生产菌株(β-CAR)，逐步引入来自泛菌(Pantoea ananatis)的β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)和来自拟南芥的玉米黄质环氧化酶(截短型ZEP)，获得紫黄质(violaxanthin)生产菌株(VIO)。关键突破在于从三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中鉴定出紫黄质脱环氧酶(VDL1)，其N端截去80个氨基酸的变体(tr80-PtVDL1)使新黄质产量提升2倍。进一步通过膜定位肽融合和脉冲补料策略，最终产量较初始菌株提高3.7倍。

关键技术包括：1) CRISPR/Cas9介导的多基因位点整合；2) 跨膜肽融合的酶定位改造；3) 半乳糖脉冲补料培养优化；4) UPLC-MS联用技术进行类胡萝卜素谱分析。

VIO菌株构建与截短酶筛选

通过逐步引入CrtZ和ZEP基因，研究人员首先获得紫黄质积累菌株。对藻源VDL1进行生物信息学预测发现其含有信号肽和转运肽，截短实验证实去除N端80个氨基酸的变体活性最佳，使新黄质产量达0.18 mg/g_DCW。

培养策略优化

发现传统培养存在48小时代谢迟滞后，采用1%葡萄糖+1%半乳糖启动培养并脉冲补料的方法，使半乳糖比消耗速率提升至0.30 g g_DCW^-1 h^-1，新黄质产量提升至0.57 mg/g_DCW。

膜定位工程

通过将tr80-PtVDL1与ZEP跨膜结构域融合，特别是C端柔性连接子构型(VDL1FL_TM)，使酶与膜底物接触效率提高，新黄质产量达0.7 mg/g_DCW，占类胡萝卜素总量的13.5%。

该研究首次在真核微生物中实现新黄质合成，产量较此前大肠杆菌体系提高2.8倍。通过揭示VDL1酶的空间定位对催化效率的影响，为其他疏水性天然产物的微生物合成提供了范例。所开发的脉冲诱导策略有效缓解了多基因表达引发的代谢压力，这对复杂途径的酵母细胞工厂构建具有普适意义。作为抗癌和抗氧化剂开发的重要原料，该成果为高附加值类胡萝卜素的绿色制造开辟了新途径。