基于免疫亲和液相色谱-串联质谱技术的杜氏肌营养不良症基因治疗后肌营养不良蛋白/mini-肌营养不良蛋白表达分析

本研究针对杜氏肌营养不良症(DMD)基因治疗中肌营养不良蛋白表达量化的技术瓶颈，开发了免疫亲和液相色谱-串联质谱(IA-LC-MS/MS)检测方法。研究人员通过分析19例接受fordadistrogene movaparvovec基因治疗的DMD患者肌肉活检样本，证实该方法可稳定、精准地定量全长和mini-肌营养不良蛋白表达，为基因治疗疗效评估提供了可靠工具。该技术解决了传统Western blot方法的定量偏差问题，对推动DMD基因治疗临床研究具有重要意义。

　　

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种致命的X连锁隐性遗传病，由于DMD基因突变导致肌营养不良蛋白(dystrophin)缺失，患者肌肉逐渐退化，通常在20-40岁因呼吸或心力衰竭死亡。虽然糖皮质激素是当前标准治疗，但只能延缓疾病进展。近年来，基因治疗成为最有希望的治疗策略，特别是通过腺相关病毒(AAV)载体递送缩短版的mini-dystrophin基因。然而，如何准确量化治疗后肌肉组织中mini-dystrophin的表达水平，成为评估疗效和获得监管批准的关键挑战。

传统Western blot方法存在定量偏差大、重复性差等问题。为此，来自国外的研究人员开发了创新的免疫亲和液相色谱-串联质谱(immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry, IA-LC-MS/MS)技术，并在fordadistrogene movaparvovec基因治疗的1b期临床试验中验证了其可靠性。这项重要研究成果发表在《Gene Therapy》期刊上。

研究人员采用的主要技术方法包括：1)建立特异性检测dystrophin/mini-dystrophin共同肽段LLQV和mini-dystrophin特有肽段LEMP的IA-LC-MS/MS方法；2)收集19例4-12岁DMD患者治疗前、治疗后60天和360天的肱二头肌活检样本；3)使用来自20例非DMD患者的骨骼肌裂解液作为正常对照；4)通过长期稳定性测试验证方法可靠性。

分析方法性能验证

研究显示，IA-LC-MS/MS方法在26个月内保持稳定性能。校准标准品的变异系数(%CV)普遍<10%，质量控制样品(QC)的批间%CV为6.0%-10.9%。正常对照肌肉裂解液(NP)中LLQV肽段的平均测量值与验证值偏差仅7%，76%的数据点在标称值±10%范围内。这些数据证实该方法具有优异的稳定性和重现性。

治疗前后蛋白表达变化

在治疗前样本中，11/19患者检测到少量"回复纤维"dystrophin(0.9-4.1%正常水平)。治疗后60天和360天，LLQV(代表总dystrophin+mini-dystrophin)和LEMP(仅mini-dystrophin)信号显著增加。两个肽段的表达变化高度一致(R²=0.91, p<0.001)，证实表达增加源自治疗引入的mini-dystrophin。典型病例显示，治疗后360天总dystrophin水平达到正常值的46.8%-61.8%。

方法学优势

与传统Western blot相比，IA-LC-MS/MS具有独特优势：1)通过检测特定肽段实现绝对定量，避免抗体识别的偏差；2)可区分内源dystrophin和治疗的mini-dystrophin；3)灵敏度高，检测下限达10 fmol/mg总蛋白；4)长期稳定性好，适合多中心临床试验。

这项研究建立了首个可用于DMD基因治疗临床试验的dystrophin/mini-dystrophin精准定量平台。其重要意义在于：1)为基因治疗产品提供可靠的生物标志物检测方法；2)解决了监管机构对疗效评估标准化的关切；3)通过mini-dystrophin的精准定量，有望建立其与临床获益的相关性，加速基因治疗审批。随着delandistrogene moxeparvovec等基因疗法陆续获批，这种高灵敏、标准化的检测技术将成为DMD临床研究和治疗监测的重要工具。