微小基因增强小鼠Spink1异源表达并纠正异常剪接的创新研究

本研究针对胰腺炎治疗中胰蛋白酶抑制的关键难题，开发了含有人工内含子的微小基因(minigene)表达系统。加州大学洛杉矶分校(UCLA)团队通过构建100-1892nt不同长度的内含子载体，在HEK 293T细胞、AR42J胰腺腺泡细胞及原代小鼠胰腺腺泡中证实，含100nt内含子的minigene可使小鼠Spink1 mRNA表达提升27.6-72.7倍，SPINK1蛋白分泌增加5.4-34.5倍，同时有效纠正cDNA载体导致的142nt异常剪接。该研究为开发高效腺相关病毒(AAV)载体治疗小鼠胰腺炎模型提供了关键技术支撑。

　　

胰腺作为人体重要的消化器官，其健康状态直接关系到营养代谢平衡。然而当胰蛋白酶原在胰腺内异常激活时，会导致严重的胰腺炎发生。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(SPINK1)作为天然的胰蛋白酶抑制剂，在保护胰腺组织方面发挥着关键作用。但令人困扰的是，临床尝试通过增强SPINK1表达来治疗胰腺炎的效果始终不尽如人意，其中基因表达效率低下和载体设计缺陷是主要瓶颈。更棘手的是，在小鼠模型研究中还发现，传统cDNA载体表达的小鼠Spink1 mRNA会出现异常的剪接现象，导致功能蛋白合成受阻。

针对这一系列挑战，加州大学洛杉矶分校(UCLA)外科系的Gergo Berke和Miklos Sahin-Toth团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究。他们创新性地将人类SPINK1基因的内含子序列引入小鼠Spink1表达系统，构建了包含100-1892nt不同长度内含子的minigene载体。通过腺病毒转导和质粒转染技术，在三种不同类型的细胞模型中系统评估了这些载体对基因表达的增强效果，同时深入解析了内含子对mRNA异常剪接的纠正机制。

研究主要采用了以下关键技术方法：构建含不同长度内含子的Spink1 minigene质粒和腺病毒载体；通过活性位点滴定法(active-site titration)精确测定SPINK1蛋白抑制活性；利用逆转录定量PCR(RT-qPCR)分析mRNA表达水平；采用琼脂糖凝胶电泳鉴定异常剪接产物；实验系统涵盖HEK 293T细胞、AR42J大鼠胰腺腺泡细胞系以及原代分离的小鼠胰腺腺泡。

内含子介导的小鼠Spink1表达增强

研究团队首先测试了含1892nt全长内含子的minigene，发现其可使HEK 293T细胞中SPINK1蛋白表达提升13.6倍。通过系统优化，他们确定100nt的最小内含子即可达到最佳效果，使SPINK1蛋白分泌增加27.1倍，mRNA水平提升27.6倍。在AR42J细胞中，100nt minigene的增强效果更为显著，SPINK1蛋白分泌量比cDNA载体高34.5倍，mRNA水平提升72.7倍。即使在原代小鼠胰腺腺泡中，100nt minigene仍能实现5.4倍的蛋白表达增强和8.2倍的mRNA水平提升。

Minigene 100纠正Spink1 cDNA的异常mRNA剪接

研究发现传统cDNA载体表达的小鼠Spink1 mRNA会发生异常剪接，导致142nt序列缺失。这种缺陷在HEK 293T细胞、AR42J细胞和原代小鼠胰腺腺泡中均被观察到。而100nt minigene几乎完全阻断了这种异常剪接，1892nt minigene也有部分纠正效果，但50nt minigene则完全无效。DNA测序证实，异常剪接发生在c.55-c.198位点之间，产生了功能缺陷的mRNA变体。

表达增强与剪接纠正的机制分离

为明确表达增强是否依赖于剪接纠正，研究人员通过c.57T>G和c.196A>C沉默突变消除了cDNA的异常剪接位点。结果显示，仅纠正剪接缺陷只能使表达提升1.7倍，而100nt minigene即使携带这些突变仍能维持30.6倍的表达增强，证实内含子的表达增强效应独立于其剪接纠正功能。

这项研究具有多重重要意义：首先，100nt minigene的优化设计为开发高效AAV载体提供了关键技术参数，将推动胰腺炎基因治疗的临床前研究；其次，揭示了内含子长度与表达增强效应的非线性关系，为基因表达调控研究提供了新见解；再者，发现并解决了cDNA载体普遍存在的潜在剪接问题，为基因治疗载体设计敲响了警钟。特别值得注意的是，该团队基于小鼠Spink1 minigene的研究成果，已成功应用于人类SPINK1基因治疗载体的开发，显示出广泛的适用价值。

研究不仅为胰腺炎治疗提供了更优的基因递送工具，其揭示的内含子功能机制更可能拓展至其他疾病的基因治疗研究。正如作者指出，这种minigene策略是否具有普适性，以及内含子增强表达的具体分子机制，仍值得在不同基因系统中进一步探索。这些发现将助力科研人员突破基因治疗中的表达效率瓶颈，为多种遗传性疾病治疗开辟新途径。