利用饱和转座子文库鉴定Schaalia odontolytica必需基因及其在口腔微生物互作中的意义

这篇研究通过构建高饱和度的Tn5转座子突变文库（Tn-seq），首次系统鉴定了口腔早期定植菌Schaalia odontolytica XH001的203个必需基因（占基因组10.5%）。研究采用改进的EZ-Tn5转座系统实现平均每2-3个核苷酸一个插入的高覆盖度，结合生物信息学分析揭示了与脂代谢（COG-I）、翻译（COG-J）等核心功能相关的基因富集特征。该成果为解析XH001与其附生体TM7x（Patescibacteria门）独特的表寄生关系提供了关键遗传工具，对理解口腔多物种生物膜（牙菌斑）的生态调控机制具有重要意义。

　　

ABSTRACT

研究聚焦口腔微生物Schaalia odontolytica XH001（原Actinomyces odontolyticus）与Patescibacteria门成员Nanosynbacter lyticus TM7x独特的表寄生关系。针对现有遗传工具的局限性，团队开发了基于高活性Tn₅转座酶的高通量突变技术（Tn-seq），在XH001中构建了包含66万次独特插入的饱和文库，平均覆盖密度达每2-3bp一个插入位点。通过严格筛选（Dval genome值≤0.01），鉴定出203个必需基因，占基因组10.5%，显著富集于翻译（COG-J）、细胞膜合成（COG-M）等核心功能类别。

MATERIALS AND METHODS

实验采用经甘氨酸休克处理的电转化感受态细胞，优化了EZ-Tn₅转座效率。六个独立文库在含500 μg/mL卡那霉素的BHI平板上筛选，通过双轮PCR扩增和Illumina HiSeq 2500测序获取插入数据。生物信息分析采用cutadapt.py修剪序列，设定最小读长阈值15，并排除基因首尾5%区域以消除极性效应。必需性预测整合了数据库比对（DEG v15.2）和代谢通量分析（BV-BRC）双重验证。

RESULTS

插入分布分析揭示典型必需基因特征：

1. 分子伴侣GroES（APY09_00740）和DNA拓扑异构酶IV亚基B（APY09_02670）全编码区无插入（图3）

2. WhiB转录因子（APY09_05580）的C-X₂-C硫结合结构域呈现插入缺失（图4B）

3. 与DEG数据库比对显示193个基因保守，但10个新发现基因（如GNAT乙酰转移酶）可能反映XH001特有代谢需求

COG分类显示必需基因在脂代谢（COG-I）和翻译（COG-J）的占比达18.7%和16.3%，显著高于基因组背景水平（图5）。与近缘菌株S. odontolytica 17982的预测必需基因比较，发现93个共同基因，支持方法可靠性。

DISCUSSION

该Tn-seq平台突破了传统遗传操作在放线菌门应用的技术瓶颈：

1. 极性插入耐受性分析揭示操纵子内基因的5‘端插入耐受现象（附图1）

2. 鉴定出MurJ家族肽聚糖合成酶等潜在新靶点（APY09_02725）

3. 为后续研究TM7x依赖性提供了基因敲除优先列表

研究局限性在于BHI培养基条件可能遗漏宿主-寄生互作特异性必需基因。未来可结合CRISPRi（基因编辑）技术进一步验证基因功能，并探索这些必需基因在口腔生物膜多物种互作中的调控网络。