稳定蝇介导的乳腺炎相关细菌在奶牛场环境中的传播与系统发育混合研究

这篇研究通过全基因组测序揭示了稳定蝇（Stomoxys）在奶牛场环境中作为乳腺炎病原体传播媒介的关键作用。研究首次比较分析了蝇类与粪便分离的大肠杆菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）菌株的系统发育关系，发现两者存在高度相似的菌株和质粒共享，证实了蝇类通过接触粪便获取并传播细菌的生态链。特别值得注意的是，研究鉴定出一个富含木糖代谢基因（xylA/xylB）的Mammaliicoccus sciuri分支，可能与乳腺炎致病性相关。这些发现为理解奶牛场环境中机会性病原体的传播机制提供了重要证据。

　　

摘要

奶牛乳腺炎每年给全球乳业造成高达320亿美元的经济损失。机会性乳腺内病原体可通过接触环境中的细菌（如粪便）传播，但其在环境中的丰度、持久性和传播因素尚不明确。这项研究聚焦于奶牛场常见的吸血害虫——稳定蝇（Stomoxys），因其与粪便和宿主的密切关联而被怀疑是病原菌携带者。通过全基因组测序技术，研究首次对蝇类和粪便分离的Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae和Staphylococcaceae进行了比较基因组分析。

引言

有效控制农业系统中的传染病对保障全球粮食系统经济稳定至关重要。在商业化奶牛场，严格的卫生措施和生物控制程序常被用于限制动物源性病原体传播。然而，关于害虫（包括昆虫）在农场环境中微生物维持和潜在传播中的作用知之甚少。Stomoxys蝇是全球奶牛场普遍存在的吸血害虫，因其与牛粪和牛宿主的密切关联而被怀疑携带病原菌。成年雌蝇偏好将卵产在老化的牛粪中，这是幼虫发育所需的营养来源；而成年蝇则需要每日从牛或其他哺乳动物宿主获取血液营养。

结果

基因组质量与分类
研究对296个基因组进行了测序（208个蝇源、80个粪源和8个乳腺炎源）。通过QUAST评估显示中位N50为285,278 bp，BUSCO分析显示221个组装包含全部124个预期直系同源基因。CheckM分析估计基因组完整度中位数为99.45%，污染率中位数为0.735%。

大肠杆菌分析
65个E. coli分离株（36蝇源、28粪源和1乳腺炎源）的系统发育分析显示，大多数属于B1谱系组。研究发现蝇源和粪源分离株在系统发育树上相互混合，包括两对具有相同序列型（ST）的蝇粪分离株。值得注意的是，一个乳腺炎源E. coli分离株与蝇粪分离株共享ST2型。功能分析发现蝇源和粪源分离株携带多种毒力因子，包括yersiniabactin铁载体生产相关基因（irp、fyuA、ybt）。

肺炎克雷伯菌分析
46个K. pneumoniae分离株（21蝇源、19粪源和6乳腺炎源）的系统发育分析揭示了三个不同的谱系，每个谱系内样本来源混合。虽然获得性ARG携带总体较少，但两个蝇源和两个粪源分离株携带ESBL基因。

葡萄球菌科分析
145个Staphylococcaceae分离株被分类为13个Staphylococcus种和2个Mammaliicoccus种。M. sciuri（前S. sciuri）是最主要的物种，有35个蝇源和11个粪源分离株。系统发育分析显示，蝇源、粪源和乳腺炎源分离株在功能注释的基因内容聚类中显著共聚。特别值得注意的是，与粪便相关的聚类显著富集了木糖代谢基因（xylA和xylB），这些基因在其他M. sciuri谱系中罕见或缺失。

质粒与抗生素耐药基因
研究发现lnuA和tetK是最常与质粒rep基因共定位的ARG。一个含有lnuA和Rep13_7的2,848 bp质粒在7个分离株中100%相同，包括蝇源、粪源和乳腺炎源分离株。

讨论

这项研究的主要目标是调查粪便相关细菌分离株向吸血Stomoxys蝇的潜在生态传播。研究结果提供了强有力的证据，表明Stomoxys蝇在奶牛场环境中作为粪便相关细菌的传播媒介。系统发育分析显示，蝇源和粪源分离株在临床相关分类群中混合，强烈表明蝇类作为机会性乳腺炎病原体的携带者，可能在奶牛场环境中作为病原体传播的重要载体。

材料与方法

细菌分离株来自先前三项研究中收集的Stomoxys蝇和环境粪堆样本。DNA提取后，使用Illumina平台进行短读长全基因组测序。基因组组装使用SPAdes，注释使用Prokka。分类鉴定通过PubMLST核糖体多位点序列分型（rMLST）数据库完成。系统发育分析使用Panaroo和FastTree进行。功能注释通过eggNOG-mapper完成。

结论

这项研究首次对Stomoxys相关细菌分离株进行了比较基因组分析，证实了蝇类通过接触粪便获取细菌的生态链，并强调了蝇类和粪便微生物组的高度重叠。这些发现为理解奶牛场环境中机会性病原体的传播机制提供了重要证据，对评估畜牧生产系统中蝇类和其他节肢动物带来的生物安全风险具有重要意义。