酵母线粒体代谢去区室化工程提升Issatchenkia orientalis化学合成效率

本研究通过创新性地解构酵母线粒体代谢区室化，实现了琥珀酸(SA)产量突破性提升。研究人员将线粒体NADH还原当量定向至胞质，并耦合还原性TCA通路(rTCA)与乙醛酸分流，使SA产量达104 g/L、得率0.85 g/g葡萄糖，同时成功拓展该平台用于乙酰辅酶A衍生物的高效合成，为真核微生物代谢工程提供了新范式。

　　

在生物基化学品生产领域，真核微生物的区室化代谢犹如一把双刃剑——线粒体等细胞器虽然为代谢反应提供了理想的微环境，却也为目标产物的高效合成设置了天然屏障。以琥珀酸(SA)为例，这种被美国能源部列为12大生物基平台化学品的重要化合物，在酵母中的生产长期受限于胞质NADH供应不足的瓶颈。传统代谢工程策略往往难以突破0.66 g/g葡萄糖的理论得率极限，因为每分子葡萄糖通过糖酵解仅能产生2分子NADH，而将丙酮酸转化为SA的还原性TCA通路(rTCA)却需要消耗4分子NADH。

美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校(University of Illinois at Urbana-Champaign)的Vinh G. Tran团队在《Nature Communications》发表的研究中，提出了颠覆性的解决方案——通过系统解构酵母线粒体的代谢区室化，成功将线粒体资源"平移"至胞质。研究人员首先在耐酸酵母Issatchenkia orientalis中实现了内源性丙酮酸脱氢酶复合体(PDH)的胞质定位，使NADH产量提升1.19倍；随后创新性地将乙醛酸分流与rTCA通路耦合，通过表达柠檬酸合酶(CIT)和乌头酸酶(ACO)构建了"代谢旁路"，部分绕过了NADH依赖的苹果酸脱氢酶(MDH)。这种双管齐下的策略不仅解决了还原力不足的核心问题，更实现了碳损失的最小化。

关键技术包括：13C代谢通量分析确定限速步骤、2H同位素示踪验证NADH穿梭效率、蛋白质组学确认酶亚细胞定位、以及基于BioSTEAM平台的 techno-economic分析。研究团队还建立了半合成脂酰化途径，解决了PDH E2亚基在胞质中的功能激活难题。

研究结果显示：

1. 线粒体丙酮酸氧化的去区室化：胞质表达IoPDH使SA产量从26.45 g/L提升至31.47 g/L，丙酮酸积累降低57%。Western blot证实关键酶成功定位于胞质。

   

2. TCA循环部分通路的重构：引入大肠杆菌来源的乙醛酸分流酶系(gltA/AceA/AceB)后，SA得率提升至0.78 g/g。同位素示踪显示²H标记的SA比例下降，证实非NADH依赖的代谢分流成功建立。

3. 规模化生产验证：在pH 3的补料分批发酵中，工程菌株SA产量达104.28 g/L，生产率0.97 g/L/h。技术经济分析显示最低售价可降至0.97美元/kg，碳足迹较石化路线降低34%。

4. 平台拓展性验证：该策略同样提升了乙酰辅酶A衍生物的合成效率，使柠檬酸(CA)和三乙酸内酯(TAL)产量分别提高1.22倍和4.35倍。

这项研究的重要意义在于：

1. 首次在酵母中实现线粒体NADH还原当量的胞质定向输送，突破了真核生物代谢工程的固有局限；

2. 建立的"代谢分流"模型为其他还原性产物的合成提供了普适性框架；

3. 证实去区室化策略可同步解决辅因子失衡和碳损失两大难题。

   

该成果不仅为生物法SA生产树立了新标杆，更开创了真核微生物代谢工程的新范式——通过智能重构亚细胞代谢网络的时空分布，实现胞内资源的最优配置。这种"细胞工厂"的模块化设计理念，为高附加值化学品的绿色制造提供了极具前景的技术路线。