靶向GNAQQ209L突变等位基因的siRNA和rAAV2-shRNA载体在葡萄膜黑色素瘤中的选择性治疗研究

本研究针对葡萄膜黑色素瘤(UVM)中普遍存在的GNAQ/GNA11Q209L驱动突变，开发了能特异性靶向突变转录本而不影响野生型的siRNA和rAAV2-shRNA载体。研究人员通过19种siRNA筛选获得P5序列，证实其可选择性清除GNAQQ209L转录本并诱导细胞死亡，随后构建的rAAV2-shGNAQQ209L载体在体外实验中显示出显著治疗效果。该研究首次实现单碱基突变的等位基因特异性靶向，为UVM精准治疗提供新策略。

　　

葡萄膜黑色素瘤(UVM)作为成人最常见的眼部恶性肿瘤，每年全球新增病例超过7000例，其最致命的特征是约50%患者会发生转移，而转移后的中位生存期仅4-15个月。这种恶性肿瘤的独特之处在于80%-90%病例由GNAQ或GNA11基因第209位密码子的单碱基突变驱动，导致Gαq/11蛋白持续激活。虽然已有抑制剂如FR-900359能阻断Gαq/11通路，但它们无法区分突变体和野生型蛋白，导致全身毒性，使得靶向治疗陷入困境。

来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill)眼科系的研究团队另辟蹊径，利用RNA干扰技术开发了能精确区分单碱基差异的治疗策略。他们设计19种靶向GNAQ^Q209L的siRNA，通过将突变位点置于siRNA不同位置来优化特异性。最有效的P5序列成功将GNAQ^Q209L转录本比例从1:1降至1:3，同时激活YAP下游基因CTGF和CYR61表达降低26%和16.3%。为延长作用时间，研究人员进一步将P5序列构建入rAAV2-shRNA载体，在三种UVM细胞系中验证发现：rAAV2-shGNAQ^Q209L可使GNAQ^Q209L阳性细胞Mel202和92.1的克隆形成减少43%-44%，而野生型细胞Mel285不受影响。该成果发表于《Molecular Therapy Oncology》，为UVM的精准基因治疗奠定基础。

研究采用四项关键技术：(1)基于Schwarz原理设计19种位点特异性siRNA；(2)通过流式分选和克隆形成实验评估细胞毒性；(3)Amplicon-EZ测序和数字PCR验证转录本选择性清除；(4)AAV血清型筛选确定AAV2为最佳载体。所有实验使用经STR验证的Mel285(GNAQ^wt)、Mel202和92.1(GNAQ^Q209L)细胞系。

siRNA设计筛选

研究人员设计19种siRNA，使突变位点从5'端第1位(P1)逐步移至第19位(P19)。在Mel202细胞中，P2和P5 siRNA显著降低克隆形成(51%-60%)和代谢活性(18%-45%)，其中P5效果最显著，使细胞呈现典型的死亡形态。

特异性验证

通过NGS分析显示，P5 siRNA处理组GNAQ^wt/GNAQ^Q209L转录本比例从1.2:1升至3.2:1。在GNAQ^wt细胞Mel285中，P5 siRNA既不降低转录本水平(p=0.347)也不影响存活率，证实其精确区分单碱基差异的能力。

AAV载体构建

血清型筛选发现AAV2在三种细胞系中转导效率最高(59%-64%)。构建的rAAV2-shGNAQ^Q209L含U6启动的shRNA和CMV-GFP报告基因。意外发现AAV2空载体对GNAQ^Q209L细胞也有轻微毒性，可能与ITR序列相关。

治疗效果评估

rAAV2-shGNAQ^Q209L使Mel202和92.1细胞代谢活性分别降低32%和61%，并伴随黑色素颗粒释放。对照载体rAAV2-shNTC毒性显著较低，表明主要疗效来自GNAQ^Q209L靶向。

这项研究首次证明基于单碱基分辨的RNAi可选择性清除致癌突变等位基因。其重要意义在于：(1)克服现有Gαq/11抑制剂无法区分突变/野生型的局限；(2)AAV载体为体内应用提供可能；(3)发现AAV本身对突变细胞的毒性为机制研究提供新线索。尽管仍需优化载体递送效率并解析AAV毒性机制，该策略为UVM及其他由单碱基驱动突变引发的癌症治疗开辟新途径。