胶原模拟肽中氮杂拟肽残基的引入及其对三螺旋结构热稳定性的调控机制研究

这篇研究创新性地将氮杂拟肽（azapeptoid）残基引入胶原模拟肽（CMP）的Xaa位点，系统探究了N-氨基甘氨酸（aGly）及其N′-烷基化衍生物对三螺旋结构热稳定性（Tm）的影响。通过固相合成（SPPS）和圆二色谱（CD）分析发现，aGly11取代虽较天然脯氨酸（Pro） destabilize 三螺旋，但选择性N′-烷基化（如异丙基、丁基）可部分恢复稳定性。研究揭示了氮杂拟肽残基在胶原工程中的模块化修饰潜力，为设计新型结构可控的CMP提供了新思路。

　　

引言

胶原作为哺乳动物结缔组织的主要结构蛋白，其右旋三螺旋结构由重复的Gly-Xaa-Yaa三肽单元构成，其中Xaa/Yaa位点通常为脯氨酸（Pro）或4-羟基脯氨酸（Hyp）。这类环状残基通过稳定PPII构象的φ/ψ二面角（-60°和+150°）维持胶原折叠，但其三级酰胺键易形成顺式（cis）构象的特性成为结构调控的挑战。近年研究发现，非天然脯氨酸类似物和拟肽（peptoid）残基可增强三螺旋稳定性，而本研究首次探索了兼具N-氨基取代和可衍生化特性的氮杂拟肽残基对胶原折叠的影响。

材料与方法

研究采用Fmoc固相合成策略，在Rink酰胺树脂上构建含7个GPO重复单元的CMP核心序列。通过溴乙酸/DIC活化结合叔丁基卡巴肼亲核取代，将aGly引入Xaa11位点；aAla11-CMP则直接偶联Boc保护的肼基丙酸。关键步骤包括：1）酸酐法N端乙酰化；2）三氟乙酸（TFA）全局脱保护；3）醛/酮还原烷基化实现aGly的N′-修饰。采用圆二色谱（CD）在225 nm监测三螺旋特征信号，通过非线性拟合计算熔点（T_m），并开展变温实验分析折叠动力学。

结果与讨论

结构稳定性分析：CD谱显示所有变体均保留典型PPII构象（225 nm正峰/204 nm负峰）。Pro11-CMP的T_m为53.2°C，而aGly11取代使T_m降至44.7°C，但仍显著高于Gly11-CMP（36.9°C），证实N-氨基化可部分补偿甘氨酸的构象缺陷。有趣的是，aAla11-CMP（T_m=39.7°C）较Ala11-CMP（46.6°C）稳定性降低，与单链PPII模型中α-取代肼基酸偏好β-折叠的结论一致。

N′-烷基化效应：通过还原胺化构建的8种衍生物中，(iPr)aGly11和(Bu)aGly11分别将T_m提升至46.3°C和46.1°C，而苯甲基（Bn）等大位阻基团反而 destabilize 结构。这与经典拟肽残基的疏水稳定化规律不同，暗示氮杂拟肽的N′-H可能参与不利氢键网络。

折叠动力学：滞后实验表明，aGly11和(iPr)aGly11-CMP的复性速率与Pro11-CMP无显著差异，说明肼键（hydrazide）的顺反异构能垒与脯氨酸酰胺键相当，这不同于δ-氧杂脯氨酸的加速折叠效应。

结论

该工作证明氮杂拟肽残基可通过模块化修饰精细调控CMP稳定性，其N′-烷基化策略为胶原工程提供了新工具。后续研究可聚焦无N′-H的全烷基化衍生物，以进一步解析氢键网络对PPII构象的影响。