快速等温检测技术在呼吸道感染相关腺病毒分型中的应用研究

这篇研究论文开发了基于五邻体基因(penton gene)的核酸扩增检测系统(NAATs)，包括定量PCR(qPCR)和重组酶聚合酶扩增(RPA)两种方法，用于快速检测引起呼吸道感染的所有腺病毒(HAdV) B、C、E型。研究建立的单管RPA检测限(LOD)≤244标准DNA拷贝，在临床鼻咽拭子检测中与qPCR结果高度一致，为院感防控和床旁检测(POCT)提供了新工具。

　　

ABSTRACT

人类腺病毒(HAdV)是导致儿童急性呼吸道感染(ARI)的重要病原体，占住院病例的15%。研究团队针对传统六邻体基因(hexon gene)检测存在的漏检风险，创新性地选择五邻体基因保守区域作为检测靶点。

Background

HAdV感染在免疫功能低下患者中死亡率高达50%，且新型HAdV毒株的hexon基因变异导致传统检测方法失效。研究聚焦B、C、E型呼吸道相关HAdV，这些型别在临床鼻咽抽吸物(NPA)中特异性存在。

Methods

通过Clustal Omega比对11个HAdV-B型、6个HAdV-C型和HAdV-E4的全基因组序列，在五邻体基因3'端发现高度保守区域。设计了两套qPCR引物探针（分别针对B/E型和C型）和通用RPA探针，使用合成DNA标准品建立标准曲线。

Results

qPCR检测限(LOD)达<10个DNA拷贝，临床样本检测显示HAdV-C型病毒载量范围为1.3×10¹-1.1×10³基因组当量/μL。单管RPA系统在20分钟内完成检测，对临床样本的检出率与qPCR一致（除1例极低载量样本）。

Conclusions

五邻体基因NAAT系统成功克服了hexon基因变异的检测瓶颈。单管RPA方案特别适用于需要快速响应的院感暴发场景，其42°C等温扩增特性大大降低了设备门槛。研究还发现该方案能意外检出部分致角膜结膜炎的D型腺病毒，为罕见呼吸道感染病例诊断提供了新思路。

方法学创新

1. 首创"三合一"RPA检测：将B/E型和C型两套引物与通用探针整合于单反应体系

2. 优化反应参数：确定42°C为最佳反应温度，190秒时增加混匀步骤显著提升信号

3. 交叉验证设计：所有引物探针均通过NCBI BLAST验证特异性，避免与非呼吸道HAdV交叉反应

临床验证

测试243例SARS-CoV-2阴性患儿的鼻咽拭子，8例HAdV-C阳性样本中7例被RPA检出。值得注意的是，病毒载量低至30基因组当量的样本出现假阴性，这与RPA检测限(LOD=138拷贝)的理论预期相符。

技术比较

与传统hexon基因检测相比，penton基因方案具有三大优势：

1. 覆盖更全：能检测hexon基因变异的新发毒株

2. 分型更准：通过两套引物实现B/E型与C型的精准区分

3. 操作更简：RPA无需热循环仪，适合基层医疗机构

该研究为呼吸道腺病毒感染的早期诊断和疫情控制提供了双重解决方案：qPCR适用于实验室精准定量，而RPA则能满足现场快速筛查需求。特别在儿科和移植病房等高风险场景中，这种20分钟出结果的检测能力将显著提升感染防控效率。