靶向ROCK2调控自噬逆转骨肉瘤MPPa-PDT耐药的新机制研究

这篇研究揭示了骨肉瘤(OS)对吡咯硼酸甲酯光动力疗法(MPPa-PDT)产生耐药的关键机制。研究发现Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)通过竞争性结合SAV1蛋白，抑制Hippo信号通路激活，进而调控细胞自噬水平，导致OS细胞对MPPa-PDT产生耐药性。研究还筛选出靶向抑制剂J059-0149，为临床逆转OS耐药提供了新策略。

　　

1 引言

骨肉瘤(OS)是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有高度侵袭性和早期转移特性。尽管手术联合新辅助化疗显著改善了患者生存率，但约30%患者仍面临化疗耐药和肺转移的困境。光动力疗法(PDT)作为新兴治疗手段，其核心光敏剂吡咯硼酸甲酯(MPPa)在OS治疗中展现出良好前景，但耐药性问题严重制约了临床疗效。

研究团队发现MPPa-PDT处理后OS细胞中Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)表达显著上调。ROCK2作为Rho/ROCK通路关键分子，在肿瘤发生发展和耐药性中起重要作用。自噬作为II型程序性细胞死亡方式，可通过清除活性氧(ROS)和保护受损细胞器来促进肿瘤细胞存活。Hippo信号通路作为高度保守的生长调控通路，与自噬存在密切互作。这些发现为阐明OS耐药机制提供了全新视角。

2 材料与方法

研究采用MG-63、U2-OS等OS细胞系及正常成骨细胞hfoB1-19，通过CCK-8筛选出0.75 μmol/L MPPa联合4.8 J/cm² 630 nm LED光的最佳处理条件。采用shRNA敲低和过表达技术调控ROCK2表达，结合自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin)和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理细胞。通过Western blot检测ROCK2、LC3II/I、Beclin-1等蛋白表达，免疫荧光和透射电镜观察自噬体形成，流式细胞术分析细胞凋亡。建立裸鼠移植瘤模型验证体内效果，并通过免疫组化分析临床样本中ROCK2与Hippo通路分子的相关性。

3 结果

3.1 ROCK2与MPPa-PDT耐药密切相关

OS细胞中ROCK2表达显著高于正常成骨细胞。RNA测序显示MPPa-PDT处理后ROCK2表达上调，Western blot和qRT-PCR证实ROCK2在蛋白和mRNA水平均显著升高。不同OS细胞系对MPPa-PDT的敏感性与其ROCK2表达水平呈负相关。

3.2 抑制ROCK2增强OS对MPPa-PDT敏感性

敲低ROCK2显著抑制OS细胞增殖，促进凋亡相关蛋白Bax表达而抑制Bcl-2。在移植瘤模型中，shROCK2联合MPPa-PDT组肿瘤体积和重量显著小于单药组。ROCK2特异性抑制剂Y27632可产生类似效果，证实靶向抑制ROCK2能有效逆转耐药。

3.3 ROCK2通过自噬调控耐药性

自噬标志物检测显示，ROCK2敲低导致LC3II/I比值降低和p62积累，而过表达则产生相反效果。mRFP-GFP-LC3双荧光系统和电镜观察证实ROCK2正向调控自噬流。挽救实验表明，自噬激动剂Rapamycin可逆转shROCK2促凋亡效应，而抑制剂3-MA能抵消ROCK2过表达的耐药保护作用。

3.4 Hippo通路介导ROCK2调控自噬

机制研究发现，ROCK2过表达降低p-MST1/2(T183/180)和p-LATS1/2(Ser909/872)磷酸化水平，抑制Hippo通路活性。细胞骨架调节剂细胞松弛素D(Cyto D)可激活Hippo通路，逆转ROCK2过表达导致的自噬增强。

3.5 ROCK2与MST1竞争性结合SAV1

免疫共沉淀和免疫荧光证实ROCK2与支架蛋白SAV1直接结合。GST pull-down实验揭示两者竞争结合SAV1的28-198氨基酸区域。ROCK2过表达增加ROCK2-SAV1复合物形成，减少MST1-SAV1复合物，从而抑制MST1磷酸化。

3.6 临床意义与靶向治疗

临床样本分析显示高表达ROCK2与OS不良预后显著相关。通过虚拟筛选获得特异性小分子抑制剂J059-0149，其可有效降低ROCK2蛋白水平，增强MPPa-PDT疗效，在体内外实验中均证实其逆转耐药的潜力。

4 讨论

本研究系统阐明了ROCK2通过"竞争性结合SAV1→抑制Hippo通路→激活保护性自噬→诱导MPPa-PDT耐药"的分子机制。创新性发现ROCK2与MST1在SAV1上的竞争结合是调控通路活性的关键开关。临床转化方面，J059-0149的筛选为OS精准治疗提供了新选择。未来研究可进一步优化抑制剂药代动力学特性，并探索与其他治疗手段的联合应用策略。

该研究不仅为理解OS耐药机制提供了理论突破，更开创了通过靶向ROCK2-Hippo-自噬轴逆转PDT耐药的新治疗范式，具有重要的临床转化价值。