健康志愿者单次微量睾酮与重组促红细胞生成素联合给药的检测技术研究

本研究创新性地评估了皮下注射15 IU/kg Eporatio（rhEPO）联合经皮100 mg Testogel（T）在健康男性中的检测策略。采用MAIIA EPO纯化试剂盒（#1410/#1460）进行免疫纯化，结合SAR-PAGE/Western blot技术实现rhEPO的高灵敏度检测（72小时内），同时通过同位素比值质谱（IRMS）证实所有睾酮样本呈阳性。研究首次验证了血清睾酮水平与IRMS结果的互补价值，为反兴奋剂领域微量内源性物质检测提供了重要方法学参考。

　　

引言

睾酮（T）和促红细胞生成素（EPO）作为体育界禁用数十年的内源性物质，近年来出现低剂量（微剂量）滥用的趋势。本研究针对15 IU/kg皮下注射重组人促红细胞生成素（rhEPO）与100 mg经皮睾酮凝胶的联合给药，系统评估了现有检测技术的灵敏度。

实验方法

5名20-36岁健康男性志愿者接受单次联合给药。采用MAIIA EPO纯化试剂盒（#1410用于初筛ITP，#1460用于确认CP）处理尿液样本，通过SAR-PAGE和Western blot分析rhEPO。干燥血斑（DBS）采用Tasso-M20设备采集，使用#1430试剂盒处理。睾酮检测结合尿类固醇谱（GC-MS/MS）和毛细管血清分析（LC-HRMS），可疑样本进一步进行IRMS确认。

结果与讨论

rhEPO尿液检测

ITP分析显示所有受试者在给药后10-48小时均呈阳性（PAAF），72小时仍保持80%检出率。6个月后采用7D3抗体进行的CP分析完全验证了初筛结果，证实rhEPO在尿液中长期稳定。值得注意的是，联合给药组的检出率（72小时80%）显著高于单独给药组（40%），提示睾酮可能影响rhEPO代谢动力学。

DBS检测比较

Tasso设备在1小时采样时全部阴性，10-48小时维持75-100%检出率，但72小时仅25%。与先前研究的Mitra（72小时60%）和Capitainer相比灵敏度较低，可能与采集体积较小（35 μL vs 40-50 μL）或聚合物基质差异有关。

类固醇生物标志物

经皮睾酮导致尿T/E比值中位数从0.9升至2.4（p<0.0004），5αAdiol/E比值从2.53升至8.85（p<0.001）。血清睾酮水平呈现3倍升高（2.46→7.48 ng/mL），但个体差异显著（6.63-12.13 ng/mL）。引人注目的是，血清雄烯二酮（A4）不受给药影响，使T/A4比值成为潜在新型标志物。

IRMS突破性发现

所有受检样本（包括T/E<4的样本）均通过IRMS确认为阳性，主要满足Δδ¹³C>3‰的标准。特别值得注意的是，使用δ¹³C值-31.7‰的Testogel时，IRMS灵敏度显著优于既往研究（-29.6‰制剂），凸显药物来源同位素特征的关键作用。

局限性

样本量较小（n=5）且缺乏连续给药数据，Tasso设备存在采样失败率（25%）。未监测网织红细胞（RET）等血液学参数，可能遗漏rhEPO与睾酮的协同效应。

结论

MAIIA试剂盒结合电泳技术可有效检测72小时内的rhEPO微剂量，而IRMS对单次经皮睾酮的灵敏度达100%。血清睾酮水平与IRMS结果的协同分析，为反兴奋剂检测提供了创新性的双轨策略。该研究为世界反兴奋剂机构（WADA）技术文件的更新提供了重要实证依据。