CRISPR-Dx与宏条形码技术在高山生态系统流域尺度哺乳动物eDNA监测中的等效性研究

这篇研究创新性地将CRISPR-Dx（基于CRISPR的诊断系统）与宏条形码（metabarcoding）技术结合，通过环境DNA（eDNA）对高海拔生态系统的哺乳动物进行流域尺度监测。研究表明，在59 bp短扩增子内设计的物种特异性CRISPR-Dx检测灵敏度与宏条形码相当，且无需全装备实验室，为偏远保护区生物多样性监测提供了高效解决方案。研究验证了eDNA流域采样整合生物信息的潜力，为稀有物种保护和景观尺度监测开辟了新途径。

　　

引言

随着人类活动对生物多样性压力的加剧，脊椎动物种群数量全球性下降，对高质量监测数据的需求日益迫切。传统监测方法如相机陷阱在复杂地形区域存在局限性，而环境DNA（eDNA）技术通过河流水样整合流域生物信息，为难以到达区域（如高山生态系统）的监测提供了新思路。本研究在瑞士国家公园（严格保护的IUCN Ia类区域）开展，旨在评估CRISPR-Dx与宏条形码在eDNA分析中的性能差异，并探索流域采样对陆生哺乳动物监测的适用性。

方法

研究区域与采样
在瑞士国家公园6个海拔1507-2613 m的流域下游采集eDNA样本，每个站点过滤80 L河水并保存于CL1缓冲液。通过乙醇沉淀法提取DNA，使用Mamm01引物（靶向12S线粒体基因~59 bp区域）进行扩增。

CRISPR-Dx设计
基于ampliscanning概念，将多物种引物与CRISPR-Dx结合：

1. 在Mamm01扩增子内设计8种哺乳动物（如阿尔卑斯山羊Capra ibex、旱獭Marmota marmota）的28 nt向导RNA序列；
2. 通过合成DNA（gBlocks）验证特异性，发现75%（6/8）的CRISPR-Dx可区分物种（除山兔Lepus timidus与欧洲兔L. europaeus存在4错配交叉反应）；
3. 采用T7启动子修饰引物进行预扩增，Cas13a介导的荧光信号检测限达0.6拷贝/反应。

数据分析
宏条形码使用Illumina MiSeq测序（2×75 bp），经dada2流程去噪和物种注释；CRISPR-Dx通过机器学习分类荧光曲线。与传统监测数据比较采用McNemar检验。

结果

技术性能

• CRISPR-Dx与宏条形码检测一致性达91%（21/23），仅两种低丰度物种（水鼩Neomys fodiens和狍Capreolus capreolus）因扩增随机性未被CRISPR-Dx捕获；
• 阳性CRISPR-Dx检测数与宏条形码读数显著相关（r=0.63, p<0.01）；
• 流域eDNA成功检测到2 km外的山羊种群，验证了eDNA长距离运输能力。

与传统监测对比
eDNA漏检高山旱獭和山兔，主因可能是：

1. 引物结合区单碱基错配（Mamm01引物）；
2. 物种与水体交互频率低；
3. 马昆站点位于湖泊出口，eDNA沉降导致信号衰减。

讨论

技术创新
研究首次在短扩增子内实现多物种CRISPR-Dx检测，突破传统单一物种检测局限。通过：

1. 多物种引物预扩增提升灵敏度；
2. CRISPR-Cas13a系统实现特异性识别；
3. 荧光/侧流层析读值降低设备依赖。

应用前景

1. 保护生物学：适用于旗舰种（如阿尔卑斯山羊）和濒危种（易危物种水鼩）监测；
2. 技术推广：在资源有限地区替代测序，单样本成本降低50%（Hoenig et al. 2023）；
3. 生态研究：揭示流域尺度物种分布格局，如红鹿（Cervus elaphus）在83%站点被检出。

局限性

1. 引物偏好性影响稀有物种检测（如旱獭）；
2. 复杂样本中CRISPR-Dx灵敏度下降；
3. 需结合机器学习优化向导RNA设计（如BADGERS模型）。

结论

研究证实ampliscanning策略可桥接物种特异性检测与群落分析，推动eDNA技术在保护地监测中的应用。未来需优化引物设计（如引入简并碱基）并扩大采样规模，以提升对低生物量物种的检测能力，为全球生物多样性保护提供标准化工具。