干细胞来源人神经网络电刺激模型在抗癫痫药物评价中的应用研究

这篇研究通过建立人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的皮质神经元多电极阵列(MEA)模型，创新性地采用电刺激诱导癫痫样后放电(ADs)，优化了±1000 mV双相电压刺激参数（100 Hz脉冲，2 s间歇期），并验证了6种抗癫痫药物(ASMs)的剂量依赖性抑制效果。该模型克服了动物模型与人类神经生理差异大的局限性，为临床前药物筛选提供了高重现性的人源化平台，尤其适用于快速评估钠通道阻滞剂(如苯妥英)和AMPA受体拮抗剂(如吡仑帕奈)的急性疗效，以及需长期孵育的突触小泡蛋白2A(SV2A)调节剂(如左乙拉西坦)的作用机制。

　　

神经网络功能发育与形态学特征

NGN2转录因子诱导分化的hiPSC源性皮质神经元与星形胶质细胞以4:1比例共培养，35天后通过免疫荧光确认成熟神经元标志物（NeuN、MAP2、β-tubulin III）。多电极阵列(MEA)记录显示，第28天出现同步化网络爆发(NBs)，伴随随机放电比例(PRS)从21天的42.3%降至35天的18.7%，突触连接趋于稳定。值得注意的是，GABA_A受体拮抗剂印防己毒素(PTX)处理可显著提升放电频率，证实培养体系中存在功能性抑制性神经传递。

电刺激参数优化与网络超同步化诱导

采用双相电压刺激（400-2000 mV，100 μs脉宽）系统评估后放电特征。当电压≥800 mV时，刺激后1秒内出现超同步化放电，1600 mV时后放电强度达平台期（AUC 81.2±6.7 spikes）。关键发现是：2秒间歇刺激(IBI)可诱导最大爆发频率(0.5 Hz)，而1秒IBI会导致网络去同步化，爆发频率反降至基线以下63%。这种"不应期"现象与神经元膜电位复极过程中Na_V通道恢复特性相关。

抗癫痫药物的差异化响应

在确立的±1000 mV/2 s IBI刺激体系下，不同机制ASMs呈现特征性抑制模式：

• 快速起效药物：钠通道阻滞剂苯妥英(PHT)和拉莫三嗪(LTG)在5分钟内呈剂量依赖性降低后放电面积(AUC)，100 μM PHT使AUC从67.1±7.3降至29.0±6.6 spikes；AMPA受体拮抗剂吡仑帕奈(PER)1 μM即可显著抑制刺激起始点放电（p<0.01）。

• 延迟作用药物：GABA转氨酶抑制剂氨己烯酸(VGB)需24小时孵育才能使100 μM浓度组AUC降低58.2%，而SV2A配体左乙拉西坦(LEV)在6小时1000 μM时才显现效果。有趣的是，苯二氮?类药物氯硝西泮(CZP)虽主要作用于GABA_A受体，但在谷氨酸能神经元为主的培养体系中仍能缩短后放电时长，提示其可能存在抑制谷氨酸释放的次级机制。

模型优势与转化意义

相比传统化学诱导（如4-氨基吡啶）方法，该电刺激模型(iMES)具有三大突破性：

1. 刺激参数可精确调控，避免化学试剂对培养环境的干扰；

2. 通过AUC分析量化药物对后放电强度的抑制，克服了爆发频率固定化的局限；

3. 兼容高通量筛选，单次实验可完成12通道/24孔板同步检测。研究者特别指出，该平台未来可整合患者特异性iPSC系，用于SCN1A等癫痫相关基因突变的个性化用药指导。

局限性与未来方向

当前模型主要局限在于NGN2分化体系以兴奋性谷氨酸能神经元为主（约占80%），未来需引入DLX2转录因子诱导的抑制性神经元共培养，以更好模拟皮层4:1的兴奋/抑制平衡。此外，三维类脑器官与微流控血脑屏障芯片的整合，将进一步提升药物渗透性预测的准确性。

这项研究为抗癫痫药物开发提供了革命性的体外评估工具，其创新性地将电生理刺激与干细胞技术结合，不仅克服了种属差异难题，更为精准医疗时代的个体化治疗策略奠定了方法学基础。