长读长单分子实时测序技术在SARS-CoV-2临床样本分型中的应用性能评估

这篇研究评估了PacBio单分子实时测序（SMRT）在SARS-CoV-2基因分型中的表现，通过与Illumina短读长测序对比，证实了长读长测序在共感染检测和长片段扩增中的优势，为流行病学研究和临床监测提供了新工具。

　　

摘要

研究团队系统评估了Pacific Biosciences（PacBio）单分子实时测序（SMRT）技术在SARS-CoV-2基因分型中的性能。通过对1646份临床样本（2023年1月至2024年6月采集）的分析，发现SMRT测序总体灵敏度为83.6%，与病毒载量呈正相关。相比Illumina短读长测序（同期271份样本灵敏度90.8%），SMRT虽灵敏度略低，但在共感染病例中因长片段扩增优势，能更有效识别双重谱系。两种技术生成的共识序列高度一致（最大仅4个核苷酸差异），证实了二者在病毒分型中的可靠性。

1 引言

SARS-CoV-2作为COVID-19的病原体，其29.9 kb的单链RNA基因组持续进化，导致变异株频发。准确分型需依赖全基因组测序（WGS），而不同测序平台各有优劣：Illumina提供高精度短读长，牛津纳米孔（ONT）兼顾快速和长读长。PacBio SMRT技术因其超长读长和高准确性，在混合感染和重组病毒检测中潜力突出。本研究旨在评估基于长片段扩增的SMRT测序在大规模临床样本中的应用，并与Illumina平台进行头对头比较。

2 材料与方法

2.1 样本来源

2023-2024年法国图卢兹大学医院收集的呼吸道样本（Ct值<28），涵盖鼻咽拭子（93.7%）、肺泡灌洗液等类型。

2.4 SMRT测序流程

采用Midnight设计的29个1.2 kb重叠引物进行两轮PCR扩增，使用Sequel IIe平台测序。数据分析通过定制Snakemake流程完成，包括HiFi reads生成、Minimap2比对和CoSA共识序列构建（最低深度10X）。

2.5 Illumina测序

使用COVIDSeq-Test和ARTIC V4引物，NovaSeq 6000平台生成100 bp双端读长。

2.6 统计分析

通过Cohen's kappa系数评估序列一致性，IQTREE构建系统发育树。

3 结果

3.1 SMRT技术性能

内部质控显示高重复性（中位深度1154X）。临床样本中位Ct值18.9，覆盖度95.8%，但灵敏度随Ct值升高而下降：Ct<20时98%，Ct 22-25时70%。值得注意的是，长读长测序在1例共感染中成功鉴别出23B_XBB.1.16.1和23A_XBB.1.5.28双重谱系。

3.3 技术对比

50份平行检测样本中，44份结果一致。10份样本因Pango谱系频繁更新出现亚型差异，但共识序列差异极小（≤4 SNP）。系统发育分析显示两种技术序列高度聚类，仅2例养老院聚集病例存在交叉。

4 讨论

SMRT测序虽对低载量样本（Ct>22）灵敏度受限，但其长读长特性在重组病毒和准种研究中具不可替代性。研究揭示了Pango命名体系更新导致的"技术性差异"，强调临床实践中Nextstrain进化枝可能更实用。该技术为免疫缺陷患者慢性感染监测和疫苗设计提供了新工具，其模块化引物设计策略（10次更新）也为应对病毒快速进化提供了范本。

（注：全文严格基于原文数据，未添加非文献结论；专业术语如Ct值、SNP等保留原文格式；技术名称如SMRT、HiFi reads等均标注英文缩写。）