深度测序联合高通量筛选开发靶向HER3的pH依赖性高亲和力结合域

这篇研究通过整合深度测序（deep sequencing）与高通量流式筛选（FACS），创新性地设计了pH依赖性HER3结合域。研究者利用首轮筛选的测序数据指导成熟库构建，结合大肠杆菌展示（E. coli display）技术，成功获得亲和力达3.3 nM（较初代提升100倍）且能在内体酸性环境（pH≈6）快速释放的HER3靶向分子，其偶联细胞毒素DM1后对HER3阳性癌细胞展现出2-5 nM的IC50，为条件性治疗分子开发提供了高效策略。

　　

1 引言

开发高亲和力且具有环境响应性的蛋白结合域是生物治疗领域的重要挑战。传统方法需通过耗时耗力的定向进化（directed evolution）和聚焦突变库（maturation library）优化，而本研究通过深度测序数据直接指导库设计，结合噬菌体展示（phage display）与大肠杆菌表面展示技术，实现了靶向HER3（人表皮生长因子受体3）的pH依赖性结合域的高效开发。HER3作为癌症标志物，其配体结合域（extracellular domain）的靶向分子设计面临亲和力与胞内释放的双重要求。

2 材料与方法

2.1 成熟库设计

基于前期CaRA（Calcium-Regulated Affinity）库筛选的深度测序数据（表S1），锁定高频突变位点（如位置17的色氨酸占比84%），构建理论规模7×10⁹的成熟库（实际覆盖8×10⁸）。通过三轮噬菌体展示筛选（表S2），采用竞争性解离（off-rate selection）和pH/钙离子条件调控，富集高亲和力克隆。

2.4 大肠杆菌展示筛选

将噬菌体输出库克隆至pPALU1载体，转化BL21(DE3)后，通过流式细胞术（flow cytometry）分析pH 7.4（含1 mM Ca²⁺）与pH 6.0（含5 mM EDTA）下的HER3结合差异。最终从72个单克隆中鉴定出候选分子CaRA_{HER3_mat17}，其pH 7.4结合信号显著高于pH 6.0（图2）。

2.7 表面等离子共振分析

SPR显示CaRA_{HER3_mat17}的K_D为3.3 nM（k_a=3.71×10⁵ M^?1s^?1，k_d=1.22×10^?3 s^?1），且与抗体Seribantumab及天然配体heregulin共享表位（图3d）。BLI实验证实其在pH 6.0的解离速率显著加快（图3e），表明pH而非钙离子驱动条件性释放。

3 结果

3.3 CaRA_{HER3_mat17}特性验证

• 结构稳定性：圆二色谱（CD）显示α-螺旋结构，熔解温度（T_m）约50°C，pH/钙离子变化无显著影响（图S3）。

• 细胞靶向性：流式实验证实其结合强度与HER3表达水平正相关（MCF-7>BT-474>SK-OV-3，图3c）。

• 治疗潜力：DM1偶联物对HER3高表达细胞SK-BR-3和BT-474的IC₅₀分别为4.87 nM和2.27 nM（图3f），而低表达细胞SK-OV-3几乎无毒性。

4 讨论

本研究通过测序数据驱动的成熟库设计，避免了传统丙氨酸扫描（alanine scanning）的繁琐步骤。尽管CaRA库预设钙离子/pH双依赖机制，但CaRA_{HER3_mat17}仅表现pH依赖性，提示两种条件可独立调控。组氨酸（histidine）的引入虽增强pH敏感性，但其数量与结合域性能非简单线性相关（如Tulika et al. 2024所述）。未来可探索双条件（pH+钙离子）设计以优化肿瘤微环境靶向性。

该策略为条件性治疗分子（如抗体偶联药物ADC）开发提供了高效模板，其模块化设计可扩展至其他靶点。尽管免疫原性待评估，但类似Affibody分子的低免疫风险（Gerdes et al. 2023）为临床转化奠定基础。