真菌扩张蛋白相关蛋白的序列与结构特征揭示其底物靶向机制

本文系统研究了20种真菌扩张蛋白相关蛋白（EXLXs）的序列与结构特征，揭示了其底物结合偏好性的分子机制。研究发现酸性蛋白（pI<5.0）优先结合几丁质，而碱性蛋白（pI>8.0）偏好结合木聚糖。通过主成分分析（PCA）发现，芳香族氨基酸含量和碳水化合物结合模块（CBM63）的存在与纤维素结合能力显著相关。该研究为理解微生物扩张蛋白的生物学功能和应用潜力提供了重要见解。

　　

真菌扩张蛋白相关蛋白的序列与结构特征研究

ABSTRACT

扩张蛋白（expansins）通过破坏纤维素微纤维与基质多糖之间的非共价键来松弛植物细胞壁网络。虽然最初在植物中发现，但随后在细菌和真菌中也鉴定出了扩张蛋白相关蛋白。微生物扩张蛋白的生物学功能尚不明确，但多项研究表明其对不同结构多糖具有独特的结合偏好。本研究在Komagataella phaffii中重组表达了20种真菌扩张蛋白相关序列，并比较了纯化蛋白对纤维素和几丁质底物的结合特性。通过测量pH对底物zeta电位的影响，并进行主成分分析，揭示了蛋白质特性（如pI、疏水性、表面电荷分布）与底物结合偏好之间的相关性。

1 引言

植物扩张蛋白参与酸诱导的植物细胞壁生长，通过非裂解作用模式触发细胞壁松弛，可能是通过破坏基质多糖与纤维素微纤维之间或相邻纤维素微纤维连接处的非共价相互作用。微生物扩张蛋白相关蛋白包括膨胀素（swollenins）、松弛素（loosenins）和巴西橡胶树蛋白（ceratoplatanins），它们具有不同的结构域组成。本研究旨在通过比较分析20种来自不同分类来源的真菌蛋白，揭示表面电荷分布、保守氨基酸位置、模块结构与实验确定的结合谱之间的相关性。

2 材料与方法

2.1 材料

实验使用了微晶纤维素（Avicel PH-101）、燕麦木聚糖、虾壳几丁质和桦木硬木牛皮纸浆等底物。

2.2 序列选择与重组蛋白生产

从Mycocosm数据库中选择的20种真菌扩张蛋白相关序列在Komagataella phaffii中重组表达。蛋白通过Ni-NTA树脂亲和层析纯化，并交换到储存缓冲液中。

2.3 真菌扩张蛋白相关蛋白序列分析

使用SignalP预测N端信号肽，EMBL-EBI Clustal Omega进行多序列比对，WebLogo 3创建序列标识。通过AlphaFold2模型预测结构，并与BsEXLX1（PDB 3D30）结构比对。

2.4 结合研究

在pH 5.0的50 mM醋酸钠缓冲液中，使用pull-down法测定蛋白与底物的结合。通过BCA法测定未结合蛋白浓度，Malvern Zetasizer Nano ZS90测量底物zeta电位。

2.5 主成分分析

使用R语言进行PCA和基于密度的聚类分析，考虑蛋白pI、电荷、疏水性、芳香性和底物结合数据等参数。

2.6 蛋白建模

使用ColabFold平台构建AlphaFold2模型，APBS-PDB2PQR网络服务器预测pH 5.0下的表面电荷分布。

3 结果与讨论

3.1 重组生产真菌扩张蛋白相关蛋白序列的比较分析

20种蛋白在K. phaffii中的表达量从2.7到393 mg/L不等。预测分子量范围为10.4-50.2 kDa，pI值范围为3.75-9.4。通过AlphaFold2模型预测，所有序列都含有高度保守的二硫键A，大多数还含有二硫键B。

3.2 真菌扩张蛋白相关蛋白显示不同的底物结合偏好

PCA分析将蛋白分为三个主要簇：簇1（酸性蛋白，优先结合几丁质）、簇2（碱性蛋白，优先结合木聚糖）和簇3（低芳香性，低纤维素结合）。zeta电位测量表明，静电相互作用在底物结合中起重要作用。

3.3 蛋白序列和预测结构与底物结合的相关性

模型结构显示，大多数真菌蛋白在D1结构域中心具有负表面，由天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基形成多糖结合表面（PBS）。与细菌EXLXs类似，酸性真菌蛋白（簇1）表现出相对负的前表面和正/中性后表面，而碱性蛋白（簇2）表现出正/中性前表面和正后表面。关键氨基酸分析显示，所有真菌序列都保守了BsEXLX1中关键的Asp82位点，这对蛋白功能至关重要。

4 结论

本研究强调了静电力对底物结合偏好的重要性，酸性蛋白优先结合几丁质，碱性蛋白优先结合木聚糖。高纤维素结合依赖于D2结构域的存在。与BsEXLX1不同，大多数真菌扩张蛋白相关蛋白含有至少两个二硫键，并在关键位置有氨基酸替代。这些发现为理解扩张蛋白活性的分子基础提供了新见解，并指导未来对不同微生物扩张蛋白相关蛋白的生物学作用和应用的探索。