嗜热菌Thermanaeromonas toyohensis来源的多域水解酶高效降解高分子量聚羟基丁酸酯(PHB)的机制研究

这篇研究报道了极端嗜热菌Thermanaeromonas toyohensis来源的新型多域聚羟基丁酸酯水解酶(TtPHBase)的独特特性。该酶通过保守的Ser-His-Asp催化三联体降解高分子量PHB，其C端结构域与碳水化合物水解酶相似但功能独特，能显著增强对PHB薄膜的结合能力。研究通过系统发育分析、AlphaFold3结构预测、热稳定性测定（Tm=72°C）及吸附实验，揭示了该酶在生物塑料循环利用中的潜在应用价值，相关研究还被纳入本科生生物化学实验课程(CURE)。

　　

1 引言

在合成塑料污染日益严重的背景下，聚羟基丁酸酯(PHB)作为可生物降解塑料备受关注。研究聚焦于极端嗜热菌Thermanaeromonas toyohensis（分离自日本550米深的地热含水层，生存环境71°C/pH5.8）中发现的多域PHB水解酶。与典型PHBases不同，该酶除催化域外还具有两个独特C端结构域，暗示其可能采用不同于Pseudomonas等菌属PHBases的FN3-SBD架构的降解机制。

2 结果

2.1 系统发育关系

通过最大似然法构建的系统发育树显示，TtPHBase与Bacillaceae等4个科的20个属细菌同源，与嗜热菌Lihuaxuella thermophila（66.6%同源）和Psychrobacillius lassicapitis（52%同源）形成明显分支。值得注意的是，高同源性菌株多具有嗜热特性。

2.2 序列与结构特征

全长614个氨基酸的TtPHBase（65.5kDa）包含：

• 催化域（42-338位）：具有典型PHB水解酶特征，含Ser¹⁵⁷-His³⁰⁵-Asp²³²催化三联体

• 新型C端域：预测为几丁质酶β-桶结构（362-427位）和DNRLRE域（472-612位）

  AlphaFold3模型显示其催化域与LtPHBase（PDB 8DAJ）高度相似（RMSD 0.29?），但C端域与藻酸裂解酶CBM96家族（PDB 7VBO）存在结构相似性，暗示其可能通过扁平中性表面结合底物。

2.3 热稳定性分析

差示扫描荧光法（DSF）和荧光光谱显示：

• 协同性去折叠：72-76°C范围内完成构象转变

• 两态去折叠模型：ΔG^0?=75.6kJ/mol（去折叠）/70.4kJ/mol（折叠）

• 最适活性温度（70°C）恰位于Tm起始点

2.4 底物偏好性

酶活实验揭示：

• 对50kDa PHB薄膜的降解效率显著高于5kDa（滞后时间15min vs 40min）

• 可有效水解500kDa PHB颗粒，与仅含催化域的LtPHBase形成鲜明对比

2.5 吸附机制

荧光标记实验证实：

• 最大吸附量[E]_o：TtPHBase（2.19μg）＞嵌合体LtPHBase-TtCterm（1.58μg）

• 遵循Langmuir吸附模型，平衡常数K_e=0.11mL/μg

3 讨论

该研究揭示了极端环境下微生物降解PHB的独特策略：

1. 通过趋同进化获得类似多糖水解酶的域架构

2. C端域通过非特异性疏水相互作用增强对高分子量PHB的结合

3. 热稳定性（T_m比LtPHBase高2°C）适应地热环境

   研究还创新性地将实验纳入本科生课程（CURE），学生通过AlphaFold建模和酶活测定参与了原创研究。未来工作将聚焦C端域精确作用机制及其在工业级PHB降解中的应用潜力。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如PHBases、RMSD、ΔG^0?等均按原文格式保留；去除了文献引用标记及图表索引）