双重靶向人鼠生长激素受体的新型拮抗剂GHA2与GHA3的研发及其在癌症治疗中的潜力

这篇研究报道了两种新型生长激素受体(GHR)拮抗剂GHA2和GHA3，通过优化B2024蛋白序列（含H18A/Q22A等位点突变）并采用胺基PEG化（5kDa）或位点特异性PEG化（40kDa）策略，显著提升了对小鼠GHR(mGHR)的抑制活性（EC50 71.6-75.6nM vs B2036的464.4nM）。在NIH-III小鼠模型中，单次给药30mg/kg可使血清IGF-1水平降低40.7%-45.8%，为癌症（如黑色素瘤B16-F10细胞）等GHR/IGF-1轴相关疾病的临床前研究提供了更优工具。

　　

Abstract

生长激素(GH)通过生长激素受体(GHR)信号转导促进细胞增殖与存活，其异常表达与癌症进展密切相关。临床唯一GHR拮抗剂pegvisomant（B2036-PEG5K）对小鼠GHR抑制效果较弱。本研究基于B2024突变体开发了GHA2（K120R/K172R突变）和GHA3（附加S144C突变），通过大肠杆菌表达系统获得高纯度蛋白，并采用差异扫描荧光法(DSF)证实其与GH结合蛋白(GHBP)的相互作用。

1 INTRODUCTION

GH通过I型细胞因子受体GHR激活STAT5等通路，其拮抗剂开发关键在于结合位点改造。B2036含G120K等9个突变，而B2024在结合位点1引入H18A等8个突变。专利数据显示B2024-PEG对小鼠IGF-1抑制更显著，但缺乏后续研究。本研究通过理性设计优化B2024序列，旨在获得双物种高效拮抗剂。

2 MATERIALS AND METHODS

细胞模型：构建稳定表达hGHR/mGHR的Ba/F3细胞系，采用resazurin法检测细胞活力。蛋白工程：将Trx-His6标签融合的GHA2/GHA3克隆至pET32a.3C载体，经Ni-NTA纯化后使用HRV 3C蛋白酶切除标签。PEG化策略：GHA2采用多位点胺基PEG化（4-6个5kDa PEG），GHA3通过S144C进行40kDa马来酰亚胺PEG化。功能验证：AlphaScreen法检测STAT5磷酸化，小鼠模型评估血清IGF-1抑制效果。

3 RESULTS

体外活性：GHA2和GHA3对hGHR的EC₅₀为15.1-16.7nM，与B2036相当；但对mGHR抑制活性提升6倍（EC₅₀ 71.6nM vs 464.4nM）。二聚体GHA3表现尤为突出（EC₅₀ 7.8nM）。信号抑制：在B16-F10黑色素瘤细胞中，20nM GHA2即可抑制86.8%的STAT5磷酸化，显著优于B2036。体内效果：GHA2-PEG5K和GHA3-PEG40K单次给药使小鼠IGF-1水平分别降低40.7%和45.8%，而B2036-PEG5K无显著影响。

4 DISCUSSION

研究首次证实B2024衍生突变体对mGHR的优越抑制性。尽管计算机模拟显示结合亲和力(kD)无显著差异，但突变体可能通过构象变化增强效能。值得注意的是，胺基PEG化产物GHA2-PEG5K在体内表现与位点特异性PEG化的GHA3-PEG40K相当，这可能与前者多PEG修饰提供的蛋白酶抗性有关。该成果为GH/IGF-1轴相关疾病研究提供了重要工具，尤其适用于涉及人源肿瘤和小鼠微环境的异种移植模型。