膜依赖性Bruton酪氨酸激酶组装：富含脯氨酸区域与SH3结构域介导的相分离机制

本研究揭示了Bruton酪氨酸激酶（Btk）通过富含脯氨酸区域（PRR）与Src同源3结构域（SH3）在膜表面形成高阶组装的分子机制。利用支撑脂质双层（SLB）和巨型单层囊泡（GUV）模型，发现膜定位可显著增强PRR-SH3弱相互作用，驱动相分离 condensates形成。该研究为膜特异性调控信号蛋白动态提供了新见解，对理解B细胞受体（BCR）信号通路及免疫疾病治疗具有重要启示。

　　

膜依赖性Bruton酪氨酸激酶组装机制

摘要

细胞膜为蛋白质动态和信号传导提供了独特的平台。研究聚焦Bruton酪氨酸激酶（Btk）的脯氨酸富集区（PRR）和Src同源3结构域（SH3），发现膜定位能放大其弱相互作用，驱动高阶组装和相分离 condensates形成。这种膜特异性现象在溶液状态下无法观测，揭示了膜环境对信号蛋白调控的关键作用。

1 引言

膜界面通过限制扩散、提高局部浓度和二维限域等特性，显著影响蛋白质相互作用网络。Btk作为B细胞受体（BCR）信号通路的核心激酶，其激活依赖于PH结构域与磷脂酰肌醇三磷酸（PIP₃）的结合。尽管PRR-SH3在溶液中的相互作用较弱（K_d~60μM），但膜环境可能增强其功能。

2 结果

2.1 扩散测量揭示PRR-SH3介导的高阶相互作用

通过荧光相关光谱（FCS）测量发现，含完整PRR-SH3的Btk在PIP₃脂质双层上扩散速率随表面密度降低，表明形成寡聚体。突变体RKSS-PRR-SH3（无法二聚化）则无此现象，证实PH二聚化是PRR-SH3相互作用的前提。

2.2 PRR-SH3驱动膜上相分离

全息显微镜显示，野生型PH-PRR-SH3在4% PIP₃ SLB上形成1μm condensates，而缺失PRR或SH3的突变体仅均匀分布。GUV实验中，野生型相分离比例达74.7%，部分突变体（如PXXP1-SH3）仍保留55.4%相分离能力，提示非经典相互作用的存在。

2.3 竞争实验验证相互作用特异性

添加肌醇六磷酸（IP₆）竞争PIP₃结合位点可迅速溶解condensates。短肽HRKTKKPLPPTPYQ能部分破坏PRR-SH3相互作用，而全长PRR片段无效，表明膜环境对相互作用的稳定作用。

3 讨论

膜定位通过PH-PIP₃结合和后续二聚化，将PRR-SH3弱相互作用转化为功能性信号枢纽。这种机制可能促进Btk对下游效应分子（如PLCγ2）的协同激活，解释B细胞中持续的Ca²⁺信号。超分辨成像已观察到免疫突触中的Btk微区，与本研究模型高度吻合。

4 结论

研究证实膜环境是PRR-SH3相分离的必要介质，为理解信号蛋白的时空调控提供了新范式。

5 材料与方法

通过大肠杆菌表达系统纯化Btk片段，采用SLB和GUV模型结合FCS、TIRF显微镜等技术，系统分析了蛋白质-膜相互作用。竞争实验使用合成肽段和IP₆，数据拟合采用2D高斯扩散模型。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，未添加非文献支持内容）