癌症相关成纤维细胞来源的CTHRC1通过LIF-STAT3通路促进胰腺癌进展与转移的机制研究

本文揭示了胶原三螺旋重复蛋白1（CTHRC1）在胰腺癌微环境中的关键作用。研究发现，CTHRC1在癌症相关成纤维细胞（CAFs）中高表达，通过激活白血病抑制因子（LIF）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号轴，显著促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。该研究为胰腺癌治疗提供了新的潜在靶点，具有重要临床意义。

　　

ABSTRACT

胶原三螺旋重复蛋白1（CTHRC1）是一种参与组织重塑和纤维化过程的分泌蛋白，在癌症中具有新兴作用。研究表明，CTHRC1主要在受损动脉的外膜成纤维细胞和新内膜平滑肌细胞中表达，促进细胞迁移和组织损伤修复。然而，CTHRC1作为肿瘤微环境因子在胰腺癌中的调控作用尚不清楚。

1 Introduction

胰腺癌是全球癌症死亡的第七大原因，即使在发达国家，5年生存率也仅为11%。中国显示出更高的发病率和死亡率，且呈逐年上升趋势，并呈现年轻化趋势。胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺恶性肿瘤的90%以上。由于其早期症状隐匿，只有10%-15%的患者符合手术切除条件，术后复发率高，5年生存率仅为15%-25%。这迫切需要探索PDAC特异性机制，寻找新的诊断和治疗靶点。

肿瘤微环境（TME）作为一种动态适应性结构，通过调节代谢重编程、免疫逃逸和化疗耐药性驱动癌症进展。PDAC的一个标志是其高度异质性的TME，包含多种成分，包括胰腺癌细胞、成纤维细胞、胰腺星状细胞、肿瘤相关巨噬细胞、免疫细胞、脂肪细胞、细胞外基质（ECM）、生长因子、细胞因子和外泌体。癌症相关成纤维细胞（CAFs）作为PDAC TME的核心成分，已被确定为癌症进展的关键驱动因素。它们通过基质重塑和旁分泌信号促进肿瘤细胞增殖、血管生成和转移前微环境形成。

本研究聚焦于分泌蛋白CTHRC1，最初在受损动脉中发现，在多种癌症（如肝癌和结直肠癌）中过表达，并与不良预后相关。首次发现CTHRC1在PDAC相关CAFs中显著上调，并与患者不良结局呈正相关。通过基因工程CAF模型，体外和体内实验证明CTHRC1促进PDAC增殖、迁移和侵袭。进一步阐明这种效应是通过白血病抑制因子（LIF）/STAT3轴介导的，从而确立CTHRC1作为PDAC的潜在治疗靶点。

2 Materials and Methods

2.1 Reagents

使用Proteintech公司的抗CTHRC1抗体、抗α-SMA抗体、抗Vimentin抗体、抗E-cadherin抗体、抗α-Tubulin抗体、抗GAPDH抗体、山羊抗兔IgG（H+L）HRP和山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP二抗。从ABclonal公司获得抗LIF抗体、STAT3和磷酸化STAT3（Tyr705）。LIF抑制剂EC330购自MedChemExpress（MCE）。

2.2 Plasmids and siRNAs

pLKO.1-shScramble和pLKO.1-shCTHRC1载体购自Sigma-Aldrich，pLenti-CMV-GFP/puro和pLenti-CMV-CTHRC1载体购自Miaoling Biotechnology。所有siRNA均购自GenePharma。

2.3 Preparation and Standardization of CAF-Conditioned Medium (CAFs-CM)

为获得CAF条件培养基（CAFs-CM），将原代培养的CAFs接种在含10%胎牛血清的iCell原代培养基中。当细胞达到80%-90%汇合时，用无菌PBS洗涤三次，并用新鲜制备的相同规格培养基孵育48小时。收集上清液，1000 rpm离心5分钟，通过0.22-μm膜过滤，滤液作为CAF-CM用于后续细胞学实验。

2.4 RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

使用Vazyme公司的RNA提取试剂盒提取培养细胞系的总RNA，并用Vazyme公司的RNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用Vazyme公司的AceQ q-PCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行qRT-PCR分析。采用2^-ΔΔC_t方法分析目标基因的相对水平。

3 Results

3.1 CTHRC1 Is Highly Expressed in CAFs of Pancreatic Cancer and Is Associated With Poor Prognosis of Patients

通过生物信息学分析单细胞测序结果发现，CTHRC1在胰腺癌CAFs中显著过表达，显著高于其在胰腺癌细胞和其他细胞中的表达水平。TCGA和GEPIA数据库分析结果显示，CTHRC1在胰腺癌中显著过表达，与其他肿瘤有显著差异。此外，CTHRC1高表达患者预后明显较差，复发和转移率显著高于CTHRC1低表达患者。Western Blot和q-PCR进一步证实CTHRC1在CAFs中高表达，显著高于胰腺癌细胞和胰腺星状细胞。人胰腺癌组织的双标记免疫荧光染色显示，CTHRC1与胰腺癌组织中的CAFs显著共定位。

3.2 CTHRC1 in CAFs Promotes Proliferation and Self-Renewal of Pancreatic Cancer Cells In Vitro

为探索胰腺癌CAFs中CTHRC1是否具有生物学功能，首先通过siRNA转染和慢病毒感染构建CTHRC1敲低的CAFs，并通过慢病毒感染构建CTHRC1过表达的CAFs。Western blot和q-PCR评估CTHRC1敲低和过表达效率。结果显示，CTHRC1敲低CAFs中CTHRC1蛋白和mRNA水平均显著下调，而CTHRC1过表达CAFs中CTHRC1蛋白水平显著上调。这些结果表明成功建立了CTHRC1敲低和过表达的CAF细胞模型，可用于后续实验。

将CTHRC1敲低或过表达的CAFs与胰腺癌细胞共培养，CCK-8细胞增殖实验显示，敲低CAFs中的CTHRC1显著抑制胰腺癌细胞增殖，而过表达CTHRC1的CAFs显著促进胰腺癌细胞增殖。此外，EdU染色实验表明，敲低CAFs中的CTHRC1显著抑制胰腺癌细胞增殖并减少细胞数量。同样，集落形成实验也显示，CAFs中的CTHRC1显著增强胰腺癌细胞集落形成能力。此外，通过球体形成实验研究了CTHRC1在CAFs中对肿瘤干细胞潜能的调控作用。与对照组相比，CTHRC1敲低的CAFs显著抑制Panc-1细胞的球体形成，表明CAF来源的CTHRC1促进胰腺癌细胞的自我更新能力和干细胞特性维持。

3.3 CTHRC1 in CAFs Promotes the Migration and Invasion Functions of Pancreatic Cancer Cells In Vitro

使用CTHRC1敲低或过表达的CAFs-CM作为下室培养基，Transwell迁移和侵袭实验结果显示，敲低CAFs中的CTHRC1显著抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭，而过表达CTHRC1的CAFs显著增强胰腺癌细胞的迁移和侵袭。同样，划痕愈合实验结果也表明，CAFs中的CTHRC1显著促进胰腺癌细胞的迁移和愈合能力。

3.4 CTHRC1 in CAFs Promotes the Proliferation, Migration, and Invasion Functions of Pancreatic Cancer Cells In Vivo

为在体内进一步研究CAFs中CTHRC1对胰腺癌进展的调控作用，建立了小鼠原位胰腺癌异种移植模型。将CTHRC1敲低的CAFs和胰腺癌细胞（Aspc-1）以1:3的比例共同注射到小鼠胰腺中。8周后，进行体内成像观察肿瘤生长和转移。然后处死小鼠，切除胰腺肿瘤。体内结果显示，与对照组相比，CTHRC1敲低的CAFs显著抑制胰腺癌细胞增殖，肿瘤体积和重量明显小于对照组。体内成像进一步证实了这些结果。此外，CTHRC1敲低的CAFs显著抑制胰腺癌向肝脏、肠道和腹腔的侵袭和转移。

3.5 CTHRC1 in CAFs Positively Regulates the Expression Level of LIF

通过RNA测序分析CTHRC1敲低后上调或下调超过两倍的基因和信号通路。分析显示，基因表达和富集最显著的变化与细胞因子相关，细胞因子-细胞因子受体相互作用通路在KEGG富集分析中排名第一。进一步检查分子细节发现，LIF是下调最显著的细胞因子之一。Western Blot和q-PCR实验在RNA-Seq样本中证实了这一结果。随后再次查询TCGA数据库，Spearman分析显示CTHRC1与LIF呈强正相关。

3.6 CTHRC1 in CAFs Positively Regulates the Activation of STAT3 Pathway in Pancreatic Cancer Cells

将CTHRC1敲低和重建CTHRC1过表达的CAFs-CM与Panc-1共培养24小时后，提取细胞蛋白，用Western Blot检测STAT3信号通路的激活。结果显示，敲低CAFs中的CTHRC1显著下调Panc-1中STAT3的磷酸化水平。在CTHRC1敲低的CAFs重建和过表达后，Panc-1中STAT3磷酸化的上调得到恢复。此外，通过集落形成和Transwell迁移实验探讨了CTHRC1敲低的CAFs重建和过表达后对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。结果显示，敲